fascin 1基因在食管癌细胞表达上调的鉴定及其功能的初步研究.docx

fascin1基因在食管癌细胞表达上调的鉴定及其功能的初步探讨Fascin1基因在食管癌细胞表达上调的鉴定及其功能的初步探讨2001级硕士探讨生：荣举导师：李恩民教授许丽艳副探讨员摘要食管癌是常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明白。有探讨发觉HPV感染与食管癌的发病有关，但原委起何作用并不清晰。为此，本探讨联合运用双向凝胶电泳、基质协助激光解吸附飞行时间质谱(MA1.Dl-ToF-MS)、RT-PCR、免疫印迹、反义核酸、裸鼠成瘤等技术F段对HPV18E6E7基因转染诱导的永生化食管上皮细胞SHEE及食管癌细胞SHEEmt之间的差异表达基因进行鉴定，并初步探讨了基因的功能，以期为揭示HpV在食管癌发病中的作用供应新线索。内容与方法：1、提取SHEE和SHEEmt细胞的总蛋白,双向凝胶电泳分别,考马斯亮蓝奥色，PDQUeSt(VerSion6.2)软件分析双向凝胶电泳图确定差异表达蛋白，进行MA1.Dl-TOF-MS鉴定。2、通过RT-PCR确定差异表达蛋白基因的转录水平，并通过CDNA克隆和DNA测序等赐予进步确认。3、通过免疫印迹对SlIEE和SlIEEmt细胞中的差异表达蛋白进行验证；通过免疫组织化学检测差异表达蛋白在临床食管鳞癌、腺癌和正常食管上皮组织中的表达状况。4、在转录水平反义封闭SHEEmt和He1.a细胞中差异表达蛋白基因的表达，视察细胞生物学特性的改变规律，初步确定差异表达蛋臼的功能。结果：1、双向凝胶电泳和Maldi-TOf-MS发觉，与shee中的比较,fascin1和磷酸丙糖异构酶在SHEEmt中在蛋白质翻译层面上表现上调。2、RT-PCR检测发觉,与SHEE中的比较,SHEEmt中fascin1和磷酸内糖异构的在mRN转录层面上均表现上调，但相比之下fascinImRNA的上调更明2显。测序结果显示，所扩增的fascin1基因片段的序列与GenBank上的fascin1基因一样。3、免疫印迹检测结果显示，与SHEE中的比较，fascin1蛋白在SHEEmt细胞中的表达水平明显增高：免疫组织化学检测fascin1在食管鳞癌和腺癌组织表达呈阳性，在正常食管上皮组织表达呈阴性，且部分正常食管上皮组织增殖旺盛的基底细胞表达呈阳性。4、构建了fascin1基因编码区部分片段的反义表达载体pcDNA3.0-fascin(一),并胜利转染SHEEmt和He1.a细胞。5、在He1.a细胞中，反义封闭fascin1基因后，细胞的丝状伪足和微棘削减，表现为聚集生长。检测结果表明，fascin1基因在转录水平表现为明显下调，但在蛋白翻译水平相应性下调表现不明显。6、反义封闭fascin1基因表达对SHEEmt和He1.a细胞的生长周期未见明显影响，SHEEm1.fascin（一）和He周-f木Ci明一）细胞仍可在SCID小鼠成瘤。结论.