中药天年饮对脾衰老延缓作用探究.docx

中药天年饮对脾苍老延缓作用探究1中药天年饮对脾苍老延缓作用探究作者：陈志宏程丽梅张宏凯谢利谯高福禄【摘要】目的视察脾的苍老变更及中药天年饮延缓免疫器官苍老的作用。方法DD半乳糖连续腹腔注射建立亚急性苍老的大鼠模型；待模型胜利建立后，用药组大鼠赐予天年饮港胃。分别检测各组大鼠血脂和脾脏指数的变更，视察脾增殖细胞核抗原(PCNA)、P53和p1.6表达的变更。结果与正常组大鼠比较，模型组大鼠的血脂和脾P53、p1.6的表达明显上升，模型组的脾脏指数和脾PCNA的表达明显卜.降(PV0.05,P<0.01)o中药天年饮11r明显改善模型大鼠脾的各种变更：与模型组大鼠比较，天年饮用药组大鼠血脂和脾p53,P16的表达明显下降，而脾脏指数和脾PCNA的表达明显上升(PV0.05,P<0.01)结论天年饮可通过阻挡脾脏的萎缩、促进淋巴细胞的增殖实力，提高苍老机体的免疫功能，可能具有延缓苍老的作用。【关键词】苍老：脾；天年饮；PCNA；p53：p1.6AbstractObjectiveToobservethesenescentchancesocspceenanctheantiDacinceccectsoctracitionacChinesecrucTiannianyinonimmuneorcans.Methocs30SDratswererancomcycivicecinto23croupsanceachcrouphac10rats:normac,acincmocecancTiannianyincroups.TheSubDacutecyacincmocecratsweremacebyinjectincDDcacintoabcominaccavitycontinuaccy.Actertheacincmocecwassuccesscuccyestabcishec,theratsinTiannianyincroupwereacministratecTiannianyinbyintracastricacministration.Thebcooccipicancthespceenincexocratsineachcroupweremeasurec,anctheexpressionsocPCN,p53ancpi6ocspceenwereobservecrespectivecy.ResuctsComparecwithnormacrats,thespceenincexanctheexpressionocPCNAinspceenocacincmocecratscecreasecobviouscy;whicethebcooccipic,theexpressionsocp53ancp!6inspceenocacincmocecratsincreasecobviouscy(P<0.05,P<0.01).Tiannianyincouccimprovethesenescentchancesinspceenocacincratssicnicicantcy:comparecWithacincmocecrats,thespceenincexanctheexpressionocPCNinspceenincreasecremarkabcyancthebcooccipic,theexpressionsocp53ancp1.6inspceencecreasecinTiannianyincroupremarkabcy(P<0.05,P<0.01).ConccusionsTiannianyincanimprovetheimmunecunctionocacecbypreventincatropyocspceenanc3cacicitatincthereprocuctiveactivityoccymphocytes,thushasbetterantiDacinceccects.Keyworcscinc;Spceen;Tiannianyin;PCNA：p53;p161988年Meites(1)提出，在苍老的过程中，免疫D神经D内分泌网络起着重要作用。淋巴器官功能降低是免疫功能紊乱的主要缘由，也与免疫功能的衰退亲密相关(2)：因此，探讨免疫系统的苍老变更具有重要的理论和实际意义(3)o脾是机体重要的免疫器官，脾的功能在整个机体的免疫功能中占有重要地位(4)；补肾、健脾是延缓苍老的重要方法。天年饮由刘河间宣明论方何首乌丸加味而成，能填精补髓、乌发延年。本探讨采纳DD半乳糖致亚急性苍老的大鼠模型，视察脾的苍老变更并探讨天年饮延缓机体免疫器官苍老的作用。1材料与方法1.1试验动物与分组雄性SD大鼠30只,体重180250co将大鼠随机分为3组：正常组、模型组和用药组，每组10只。其中模型组和用药组大鼠均采纳DD半乳糖连续腹腔注射(按200mc/kc给药，每天1次，连续40C)制作亚急性苍老的动物模型；模型组大鼠造模胜利后不再做任何处理，用药组大鼠造模胜利后每天用天年饮灌胃，共30C1.2 药品与试剂天年饮由灸何首乌、怀牛膝、肉从蓉、4淫羊蕾、丹参、茯苓六味中药组成，煎制后每me含生药1.5c,按16.2c/kc灌胃给药。检测血清中总胆固醉(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(D(DC)含量的试剂盒购臼北京中法生物公司；增殖细胞核抗原（prociceratincceccneuccearanticon,PCNA）P53、p16免疫组化试剂盒购H武汉博士德生物工程公司。1.3 血脂大鼠经内眦取血，离心后取上清，应用日本日立公司BoehrincerMannhein/（itachi717全自动生化分析仪分别采纳酶法和干脆法检测TCsTG和（Da）Co1.4 脾脏指数大鼠称重，断头处死，快速取出脾脏后去除脂肪、筋膜后称重，计算脾脏指数，脾脏指数=脾脏重量/体重。1.5 （E及免疫组化染色称重后的脾脏入Bouin液固定，常规石蜡包埋，连续切片（片厚6m）,贴于涂有APES的载玻片上。1.5.1 （E染色苏木精D伊红染色视察牌的组织结构。1.5.2 免疫组化染色及定量分析采纳SABC免疫组化染色视察大鼠脾PCNA、P53、p1.6的表达状况（PCN一抗为小鼠抗体,p53、P16一抗均为兔抗体，一抗稀释比例均为1:100）,以细胞核出现棕黄色为阳性反应，以PBS代替一抗作为阴性比照。每只大鼠子显微镜下（1020）任选5张切片，每张切片选取3个阳性细胞分布匀称的视野，采纳MiVnt图像分析5系统，计算阳性细胞面积占视野面积的比值，取平均值作为这只大鼠的阳性率。1.6 统计学处理采纳SPSS11.0统计软件，以方差分析进行统计处理，组间比较采纳q检验。2结果2.1大鼠血脂的变更与正常组大鼠比较，模型组大鼠血清TC、TG含量明显上升，（D（DC含量明显下降（P<0.05,P<0.01）：中药天年饮可明显降低苍老大鼠血清TC和TG含量，提高（DC含量，用药组与模型组比较差异显著（PVO05,P<0.01）（见表Do表1大鼠血脂及脾脏指数与正常组比较：1）P<O.O1,2）P<0.05：与模型组比较：3）P<0.01,4）P<0.052.2大鼠脾脏指数的变更与正常组比较,模型组大鼠脾脏指数显著下降（PV005：中药天年饮可明显提高苍老大鼠的脾脏指数，用药组与模型组比较差异显著（P<0.05）O2.3脾组织结构的变更光镜下视察可见，正常组大鼠脾白筒、红髓清楚，脾小体内含大量B淋巴细胞，动脉四周淋巴鞘含大量T淋巴细胞，红髓内脾血窦清楚可辨（图1.）o模型组大鼠牌臼髓体积缩小，脾小体少见，脾小梁内结缔组织增生,脾血窦明显淤血（图2）o用药组大鼠脾臼髓体积与正常组大鼠相比无明显变更，脾小体可见，脾小梁内结缔组织无明显增生，脾血窦淤血明显减轻（图3）o62.4大鼠脾PCNA表达的变更PCNA阳性产物为棕黄色，位于细胞核。正常组大鼠脾小体生发中心可见大量PCNA阳性的B淋巴细胞，但阳性程度较弱；动脉四周淋巴鞘可见PCNA阳性的T淋巴细胞；脾索可见PCNA阳性的浆细胞和网状细胞，阳性程度较强：脾血窦壁内皮细胞和平滑肌细胞未见阳性产物（图4）»模型组大鼠脾小体、动脉四周淋巴鞘中PCNA阳性淋巴细胞均明显削减；脾索中可见PCNA阳性的浆细胞和网状细胞（图5）o用药组大鼠脾PCNA的表达状况与模型组比较明显改善（图6）。模型组大鼠脾PCNA的阳性表达率明显低于正常组大鼠（PV0.01）；中药天年饮可明显改善模型大鼠脾PCNA的表达状况，与模型组比较，用药组大鼠牌PCYA的阳性表达率明显上升（PV0.01）（表2）O2.5 大鼠脾p53表达的变更p53蛋白阳性产物为棕黄色，位于细胞核。正常组大鼠脾动脉四周淋巴鞘及红髓中均可见P53阳性的网状细胞，模型大鼠脾中p53阳性细胞明显增多，用药组大鼠脾p53阳性细胞较模型组明显削减（图79）。各组大鼠脾p53蛋白的阳性率见表2,模型组大鼠牌p53的阳性表达率明显高于正常组（PVO.01）：中药天年饮可明显降低模型大鼠脾p53的表达，与模型组比较，用药组大鼠脾p53的阳性表达率明显降低（PVO.01）。2.6 大鼠脾p1.6表达的变更p1.6蛋白阳性产物为棕黄色，位于细胞核。正常组大鼠脾红髓中可见p1.6阳性的网状细胞，7模型大鼠脾中P16阳性细胞明显增多，用药组大鼠脾p1.6阳性细胞较模型组明显削减（图10-12）O各组大鼠脾P16蛋白的阳性率见表2,模型组大鼠脾p1.6的阳性表达率明显高于正常组大鼠（P<0.01）；中药天年饮可明显降低模型大鼠脾P16的表达，与模型组比较，用药组大鼠脾p1.6的阳性表达率明显降低(P<o.o)°表2各组大鼠睥PCMA、p53和P16的表达变更3讨论早在上世纪六十年头就有学者提出了苍老的免疫学说，认为免疫功能的衰退与机体的老化亲密相关，在全部器官系统的苍老过程中，以免疫系统最早出现苍老，且对机体的影响最大，探讨免疫系统的苍老变更具有重要的理论和实际意义(3)»免疫系统是机体苍老过程中的主要调整系统之一，参加了苍老的全过程。苍老可使机体的免疫功能下降，免疫器官如骨髓、脾、胸腺和淋巴结等出现萎缩等不同程度的变更(5)：并有观点认为，苍老与免疫功能的状况亲密相关(6)。脾是机体内重要的免疫器官，在异种抗原的刺激下脾小体分化增殖，产生B淋巴细胞及浆细胞,动脉四周淋巴鞘显著增厚，产生T淋巴细胞，这些变更均与体液免疫和细胞免疫亲密相关；另外，肿还能产生与免疫调整有关的活性物质，脾的功能在整个机体的免疫功能中占有重要地位(4)8PCNA是存在于细胞核中的酸性蛋白质，其表达的强弱可干脆反应细胞增殖/凋亡的程度和是否存在细胞的恶性累积增殖。p53和p16都是抑癌基因，p53基因可参加细胞周期的调控，具有阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组的稳定及抑制肿瘤血管生成等多方面的功能；p16基因编码的p1.6蛋白为细胞周期的一种负性调整因子，可与细胞周期素D竞争结合细胞周期依匏性激酶（CDK4）,阻挡细胞从G1.期进入S期,从而抑制细胞增殖。本探讨发觉，模型组大鼠脾脏指数、牌PCNA的表达明显降低，脾p53和p16的表达明显上升，模型大鼠与正常大鼠比较差异显著（P<0.05,P<0.ODo表明模型大鼠脾萎缩，脾内淋巴细胞及浆细胞等的增殖实力下降、凋亡增多，因而合成免疫球蛋白的数量削减，对外界病原的反抗实力下降，从而导致机体其他器官、系统的一系列病理变更。传统中医学认为脾主运化是脾的主要生理功能之一，且是脂质代谢的关键（包括脂质的汲取、合成、水解、转移与排泄等）（7）o李中梓的医宗必读有记载：脾上虚弱，清者难升，浊者难降；现代探讨也表明，牌功能失调可导致脂质代谢障碍（8,9）。本探讨结果与其他学者的探讨结果一样，模型大鼠脾功能下降、血脂代谢异样。由于TC、TG的含量上升，大量的TC、TG进入线粒体经氧化分解，导致大量活性氧（ROS）的生成；微量ROS能参加细胞内的信号9转导，对基因表达、个体发育起到生理性调控作用（10）；但过量的ROS反过来可以攻击位于线粒体内膜上的脂类、蛋白质和mtDN,影响线粒体的功能，导致细胞受损、苍老和疾病的发生（11）.还有探讨认为血脂上升（TC、TG含量上升，（D（DC含量下降）可使动脉管壁增厚，导致患心血管疾病的危急性增加（12）,这些变更均加速了机体的苍老进程。延缓苍老的主要目的是提高生活质量、改善体质并有.效延长机体寿命。中药天年饮是我院中医系主任贾春华教授在刘河间宣明论方何首乌丸的基础上加味而成的，何首乌丸本由何首乌、肉灰蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年；于此基础上加淫羊蕾补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏。本探讨发觉中药天年饮可以改善模型大鼠的血脂代谢、提高模型大鼠的脾脏指数和脾PCNA的表达、降低模型大鼠脾p53和p16的表达、并对模型大鼠脾的组织结构具有明显的爱护作用，说明天年饮可通过推迟或阻挡脾脏的萎缩、促进淋巴细胞的增殖实力来提高苍老机体的免疫功能，而机体免废功能的提高又有助于防治老年病和延缓机体的苍老过程，从而证明中药天年饮具有良好的延缓苍老作用。【参考文献】1MeiteSJ.Neuroencocrinebiomarkersocacincintherat(J).ExpGerontoc.1988：23(4D5):349.102(arbi.FranceschiC,MazzattiD,etac.cincoctheimmunesystemasaprocnosticcactorcorhumanconcevity(J).Physiococy(Bethesca),2008；23:64D74.3KumarR,BurnsEA.AceDrecatecceccincinimmunity：impcicationscorvaccineresponsiveness(J).ExpertRevVaccines,2008；7(4):4671)79.4CestaMF.Normacstructure,cunctionanchiStococyocthespceen(J).ToxicocPathoc,2006；34(5):455065.5GruverA(,(ucson(,ScnipowskiGD.Immunosenescenceocaceinc(J).JPathoc,2007；211(2):144D56.6PawccecG.Immunityancaceincinman(J).ExpGerontoc,2006；41(12):1239D342.7IshicaT.IchiharaM,WaneX,etac.SpceenpcaysanimportantroceintheincuctionocacceceratecbcoocccearanceocPEGycatecciposomes(J).JControcRecease,2006；115(3):243D50.118PetroianuA,VecosoDF,CostaGR1etac.Eccectsocspcenicsurceriesoncipicocramocrats(J).RevAssocMecBras,2006；52(1):56D9.9Petroianu,VecosoDF.Acberti(R,etac.Pcasmacipicacterationsactertotacspcenectomy,subtotacSpcenectomyancspcenicauIoDimpcantsinrats(J).JGastroenteroc(epatoc,2007；23(7Pt2)：e221D4.10DroceW.Freeracicacsinthephysiococicaccontrococcecccunction(J).PhysiocRev,2002：82(1):47D95.11StDPierreJ»BuckinchanJ,RoebuckSJ,etac.TopococyocsuperoxiceprocuctioncromciccerentsitesinthemiIochoncriacecectrontransportchain(J).JBiocChcm,2002；277(47):44784D90.12VanDamMJ,ceGrootE,CceeSM,etac.AssociationbetweenincreasecarteriacFhvaccthicknessancimpairmentinABC.IDcrivenchocesterocecccux：anObservationacstucy(J).(ancet»2002；359(9300):37D42.12