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乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前X基因的分子流行病学意义(医学论文)乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前X基因的分广流行病学意义【摘要】目的：了解前X基因在HBV相关HCC患者中的流行病学分布、前X基因和HBV基因型与HCC的临床关系.方法：患有乙肝的肝细胞肝癌患者(HCC)35例，采纳型特异性引物巢式聚合随链反应进行基因分型.同时对明确基因分型的肝癌患者，扩增前X区，TA克隆到PMD18T载体后进行单克隆测序，分析前X区在肝癌患者的表达状况，对前X区和基因型及相关病情进行探讨.结果：HCC患者35例中B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例.明确基因型的患者33例，进一步扩增前X区，并经TA克隆获得93个单克隆株中，经测序表明，有65个单克隆株编码前X多肽，占69.9%.HCC患者33例中有29例编码前X多肽，编码率为87.9%,高于慢性乙型肝炎患者58.8%的编码率.C基因型前X多肽编码率为91.6乐B/C混合型编码率为87.5%(Pgt;0.05),B基因型无编码.前X区的表达与年龄，性别，家族史，AFP,HBVDNA,A1.T水平间无关(Pgt;0.05).结论：HCC患者中C基因型、B/C混合基因型较为多见.前X多肽在HCC患者中有较高的编码率，前X区多肽可能和HeC之间有确定相关性.【关键词】肝炎病毒乙型基因型前X基因癌肝细胞O引言乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）在其负链上含4个部分重登的开放读码框架（OPenreadingframe,ORF）即前S/S区、前C/C区、P区和X区，分别编码7种性质不同的蛋臼如HBcAg,HBcAg,HBsAg等.有探讨表明，X区编码的HBxAg与肝细胞肝癌（HCe）的形成亲密相关1.探讨证明，在XORF的上游还存在一个新的ORF即前XORF2,而关于其的功能探讨尚不多见，是否具有类似功能尚不确定，我们对前XORF功能进行初步探讨.1对象和方法1.1.对象200401/200412HBVDNA阳性的HCC患者35例.全部患者均经B超、CT和核磁共振（VRD或血管造影等临床诊断为乙肝相关性肝癌，采纳蛋白筋K、酚氯仿异戊醇法提取血清HBVDNA.乙肝标记物（HBVM：HBsAg,AntiHBs,HBeg,AntiHBe,AntiHBc）的测定均采纳E1.ISA法检测，试剂由华美生物工程有限公司供应.生化指标（A1.T）由我院全F1.动生化检测仪常规测定.1.2方法通过比对不同HBV基因型序列以及参考Natio3等设计的6种主要基因型的分析方法，设计了共同的外引物P1.,P2,进行PCR扩增，并以扩增产物为模板进行基因型特异性内引物扩增.基因型特异性内引物扩增分为A,B两组，其中组包括共有的上游引物P3,PA（基因型A特异性下游引物），PB（基因型B特异性下游引物），PC（基因型C特异性下游引物），B组包括上游引物P4以及基因型D,E,F的特异性下游引物PD,PE,PF,同时行PCR扩增.取第2轮PCR扩增产物51.经过20g/1.琼脂糖凝胶电泳后推断HBV基因型，依据电泳结果推断HBV基因型.以35例HCC患者中明确HBV基因分型的33例患者HBVDNA溶液为模板，依据前X上游引物Px1.,下游引物为Px2,扩增前X区4.Px1.下游第3133nt处为前X区起始密码子TG,Px2上游3032nt处为X区起始密码子ATG,犷增的靶区域全长231nt,其中前X区全长为168nt,将PCR产物回收并连接至PMD18T载体，将连接好的重组体转入感受态细胞，经宓卡青霉素（AmP）和Xga1.蓝白斑法初步筛选阳性菌落，进一步提取质粒采纳PCR法鉴定.对经过鉴定的胜利导入前X基因的菌落送测序.统计学处理：全部数据应用SPSS13.0统计软件分析，不同组间率的比较采纳2检验，均数比较采纳t检验.P1.tiO.05表示有统计学意义.2结果2.IHBV基因型应用该基因型分型方法，A组PCR产物电泳时A基因型为68bp,B基因型为281bp,C基因型为122bp（图1）刀组电泳时D基因型为119bp,E基因型为167bp,F基因型为67bp.本组的35例患者中，B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例，未见其他基因型.2.2前X基因PCR扩增扩增的靶区域全长231bp,胜利构建出PMD18T前X载体后，以PMD18T载体上游引物M13和Px1.为上游引物、Px2为共有的下游引物同时行PCR扩增，可得到308bp和231bp的片断，说明克隆胜利.2.3前X基因序列分析经鉴定胜利导入重组体的菌落，随机共选取93株送测序.前XORF全长168bp,位于测序片断的第31位至第198位，依据其测序结果推定核甘酸序列如下：ATGGGGCTTGGcTATTGGccATcGCCGCATGCGTGGAACCTnGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACnATCGGAACCGACAAcrCTGnGtcctctctcggaaatacacctcctttcc：在这93个克隆中有65个克隆在第3133bp处为ATG,而该位点即为前X基因的起始位点，是胜利编码前X多肽的关键所在，占所测核甘酸序列的69.9%.而经过进一步分析发觉，在前X基因全长168bp中未发觉终止密码子的出现，导致其余28个单克隆不能编码前X多肽的缘由在于该位点出现了AC替换突变，使其不能正常编码.2.4前X多肽在HCC中的分他来自同一例患者的不同单克隆中，只要有一个单克隆可以编码前X多肽，就认为该患者可以表达前X基因.在来自己知基因分型的33例HCC患者，随机选取的93个单克隆中，有65个克隆可以编码前X多肽，分别来自29例患者：而在剩余的28个单克隆株中，有3个单克隆来自同一患者，而相同的状况还出现在另外3个患者，即共有4例患者被认为不能胜利编码前X多肽.2.5前X基因分析在已知基因分型的33例患者中有B基因型1例，C基因型24例，B/C混合型有8例.1例B基因型患者中3个单克隆株皆未表达前X多肽、24例C基因型患者中有C株72.5%(5069),8例B/C基因型患者有15株71.4%(15/21)能胜利编码前X多肽，即24例C基因型患者中有22例可以编码前X区，约占91.6%,8例B/C混合型患者有7例可以编码前X区，约占87.5%,因B基因型例数较少，仅对C基因型、B/C混合基因型进行分析，前X区在C基因型、B/C混合基因型中表达率无统计学差异.与既往慢性乙型肝炎人群中做的前X基因调查结果相比较4,前X基因在HCC患者中的表达率高于CHB人群，前X区在不同人群中分布有所不同，在HCC人群中表达率较高(表1).依据前X基因的表达与否将其分为2组，探讨前X区与临床相关资料如年龄、性别、家族史、乙肝标记物、HBVDNA等之间的关系(表2).表1前X基因在不同人群中的分布状况表2前X基因与年龄、家族史、性别的关系3探讨HCC的发生是一个多基因、多途径的困难多阶段过程.HBsAg阳性者进展为HCC的危急性比HBsAg阴性者增加了100倍以上.目前对HBV长期感染导致HCC发生的具体机制尚不完全明确IiJTakahashi等5于1995年探讨曾发觉前X区的存在外，近期有探讨证明前X区存在的确定性6,但关于前X基因的功能探讨较少7,为了更具体的了解前X基因在HCC患者中的表达状况，明确前X基因与HCC的发生有无相关性，对进一步探讨前X区的功能供应一个方向，我们以HBVDNA阳性的HCC患者为探讨对象，进行前X基因分子流行病学调查.本试验探讨结果表明，在已知基因型的HBVDNA阳性的HCC患者体内普遍表达前X基因，同时，经过比较，前X基因在HCC患者中表达率明显高于慢性乙型肝炎患者，具有显著性差异，说明在疾病的不同阶段，其前X基因表达不相同，提示前X基因可能与HCC的发生亲密相关.此外，本探讨还提示应对慢性乙型肝炎表达前X的患者进行长期的动态视察，进一步明确前X基因与HBV所致的疾病不同状态的相关性.并且我们发觉，前X区主要集中表现在C基因型，但是在B,C混合型中也有较高的表达率，二者并无显著性差异.由于我们所做的HCC患者中只有1例B基因型，虽未能表达前X基因，但不能解除样本量的影响.本试验表明前X区具有确定的基因型倾向性，但不能确定是否具备基因型特异性.有探讨表明年龄、性别的不同在乙型肝炎演化为肝癌的过程中存在着明显的差异.但我们发觉，年龄、性别的不同在前X区的表达组与未表达组均无明显差异.从乙肝病毒复制指标分析，无论是HBVDNA水平还是HBeAg阳性率，前X区表达组均高于未表达前X组的HCC患者，但均无显著性差异.前X表达的HCC患者在肝功能损害水平1.T水平、AFP阳性率与未表达的前X区的HCC患者同样无明显差别.这些均说明前X区的表达与性别、年龄等临床相关指标无明显关系，但尚不能解除样本量的关系，仍需进一步视察.我们的探讨表明，前X基因的编码在HeC患者中具有普遍性.这也就提示在HCC患者体内，可能还存在着一个始终未被探讨的蛋白即全X蛋白.而其与HCC发生、发展过程的关系或许比HBXAg更为紧密，对其功能及具体机制的探讨仍须要我们不断的深化.【参考文献】1TangH,OishiN,KanekoS,eta1.Mo1.ecu1.arfunctionsandbio1.ogica1.ro1.esofhepatitisBvirusXproteinJ.CancerSci,2006,97(10):977-983.2董菁，成军.乙型肝炎病毒前X基因的初步探讨口.世界华人消化杂志，2003,11:1097-1101.3NaitoH,HayashiS,beK.RapidandspecificgenotypingsystemforhepatitisBviruscorrespondingtosixmajorgenotypesbyPCRusingtypespecificprimerJ.C1.inMicrobio1.,2001,39(1):362-364.4黄菁，杨倩，成军.乙型肝炎病毒基因组前X区的分子流行病学探讨J.世界华人消化杂志，2004,12(1)：42-46.5TakahashiK,KishimotoS,OhoriK,eta1.uniquesetofmutationsinthepreXregionofhepatitisBvirusDNAfrequent1.yfoundinpatientsbutnotinasymptomaticcarriers:imp1.icationforanove1.variantJ.IntHepato1.Commun,1995,3:131-138.6董菁，成军，杨倩.乙型肝炎病毒新开发读码框架的确定及其意义J.世界华人消化杂志，2004,12(4)：757-762.7薛红安，杨倩，刘拉羊，等.乙型肝炎病毒全X基因的克隆及原核表达J.第四军医高校学报，2004,25(23)2133-2135.