乙肝病毒特性与致病机理研究进展[1].docx

乙肝病毒特性与致病机理探讨进展王晓冬，王峰.吕月蒙，李强,张国峰，孙涛,贾亚雄甘肃农业高校生命稗学技术学院,甘肃兰州(730OTO)E-mai1.：摘要：乙型肝炎病毒(HePaIi1.iSBVirus.HBV)是引起中国及东南亚一带病#性肝炎的主委病夜之一,有半咏以上HBV惑来的患者将会发展.为慢性肝炎(ChronicHepatitis,CH>,肝硬化(1.ivcrCitThosis.1.C),至肝细电？IIn点(HCPatoCCuUIarCarCinOma.HCC),常被形葬的孙之力“慢性肝病三步曲新近有多项狄对表明活化的T细处反应可能在HBv感柒的慢性化和肝统的拗伤过程中起至寮作用。CcM+ThE的可分为和Th2细胞，分刖介导两种不同的能疫学效应。Th1.评胞主要分泌I1.2.IFN-X和肿瘤坏死因子(TNF)寻细胞因子.参加统胞更我应务:Th2细胞主要分泌I1.-4.I1.-5.11.-6和I1.-Io等如他EI子.参加体液免被应各:Th1."h2的平衡缩定了M农庄各的有效性和平安性.Th1.与Th2之间存在相互制约或促进左右，相的国子姐找一个固煜的分子网络，参加调任炎症反应以及招官功能的自我也定。关键词：摘胞因子,乙曳肝炎扃毒.统胞毒性T淋巴同胞1 .引言乙蛰病珞性肝炎(hepatitisB.HB)是由乙里肝炎精毒(hepatitisBvirus,HBV)引起的。HBV的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎,而且还与肝硬化(IiVerCinho$is.1.C)和肝细胞施(hepatoce1.1.u1.arcarCinoma、HCC)的发生、发展亲密相关.20%的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV慢性感染的人稚患HCC的危急性是正常人的100倍，HBV将染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利业为低流行区，乙性肝炎病患表面抗原(hcpa1.i1.isBsurfaceantigen.HBsAg)携带率在2%以下：东欧、H本、南美、北美和地中海国家为中流行区：中国、东两亚与南非为高流行区(HBSAg携带率10%左右).全世界共有约3.5亿人为HBSAg假性携带者，其中3/4在亚洲HBV感染导致全球彼年50120万人死亡，其中死于HCC的约占32万。我国是HBV感染的高发区，约60%的人群感染过HBV,10%的人群为携带者,多达1.2亿.现有乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为15&“0万"T随芾HBV投苗在1982年的问世，HBV出鎏率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了确定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍旧不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量浩大，面临发展为肝硬化和肝癌的危急,不幸的是，到目前为止,还没仃针对HBV的特效裕物.因此.乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍旧是一个严岐的问以.找寻更有效的治疗途径是医学探讨的电大课JB.2 .HBV的生物学特性2.1 HBV的生物学分类1986年国际病毒革命委员会正式招人类HBV划归为一个新的病毒科一一嗜肝DNA病盘科(HCPadnaViridaC)的成员.该科病毒成员除了人HBV外还有：<1)东方七拨就肝炎病毒(GHV),1978年在荚国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发觉该病诉。东方土拨IR肝炎和肝癌的发病率较高：(2)地松网肝炎病毒(GHV),是1980年在美国南加州的地松鼠中发觉的：(3)鸭乙型肝炎病毒(DHBV),1981年在我国江苏竹启东县肝癌高发区分别自易发生肝箱的麻将，后来在北京能终俾和美国商品料中也发觉此病毒IXi2.2 HBV的形态与结构HBv在动物病揖中是不寻常的,是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗粒电镜下视察HBV的提纯制品,证明有三种类型颗粒"工1 .小球蟹颗粒平均直径为22nm,由空心捕毒包股组成，是HBV多余的衣壳蛋白,没有病毒核酸.无感染性,但刺激机体产生相应的抗体,具有中和病语的作用,制备乙肝疫帚即由此种颗粒组成.2,管型颗粒由小球型脓粒连接而成，其长城不一。小球型颗粒和管型颗粒的产生是由于病毒颠粒包腴产量过粥，小球型颗粒和管基颗粒与DUne颗粒的比例依不同的病程差异较大，一般微DanC桃粒的1.(10$倍,在患者血液中的含域可高达10”个Jm1.3 .Dane颗粒为完整的具有感染性的物而颜粒，出径为42nm,由包膜和核衣壳祖成”核衣光直径为27nm,含有HB1.Ag,单一分子的部分双链DNA以及依称DNA的DNA聚合酹，核衣壳很重要的一个功能是作为病馋基因组的爱护性容零.另一独特的特征是P蛋白与长DNAtft共价结合.在患者血液中的Dane收粒含盘为101()"个/m1.图一电子显很横F可以视察到乙肝病选3种不同的形态:大球形颗粒,小球影颗粒和诉杉狼*"0-2-图:肝病冷（HBV）结构示-图102.3 理化特性及反抗力在乳化艳平衡梯度离心中，HBV驰粒（42nm>的浮力为1.22gCm:表面抗原煤粒（22nm）为1.228cm',病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干型的30%.HBV对理化因素有较强的反抗力。病淮在30321C可存活至少6个月，在-201C可存活15年.病毒浓度高时.60X?加热IOh,或98C加热Imin.以及乙瞌或pH2.4处理均不能仃放灭活乙肝病毒,能够灭活HBV的常用方法和条件包括I2C1压灭菌20min.I6O"C干燧Ih,100e干脆煮沸2min,以及0.5%过料化酸，3%漂白粉溶液，5%次烈酸钠和环氯乙烷等的干脆处理HBV的感来性并非与其抗原性和免疫原性相一样，在一些能膨灭活HBV感染性的条件下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保傍UT2.4 HBV的基因组和蛋白组成HBv基因组结构特殊，成不完全闭合的双性形式,负<-）琏为全长基因.约含32（M）个核甘酸，而正（+）链是负胜长度的2080%,病毒颗粒内含有DNA聚合相.在全部已知可然染人体而且具彳j独立双制实力的双链DNA病毒中，HBv址因殂是最小但又是最高效的.它具有以下4个显明的特点""川：< 1）不完全以健环状结构：< 2>利用.取神的开放注码框（OpenrvadingframeORF）编码多个蛋臼即< 3>全部调控序列均位于蛋白质编码区内；< 4）基因序列具有多变性.图二HBV系因组她本结构HBV含有4个ORF,即S区（包括PrCS1、PrCS2及S）、C区（包括Pree和C、P区和X区ORF之间相互更会.HBV有4种转录予，共用一个PHyA加尼信号，氏度分别为3.5kt2.4 kb.2.1kb和0.7kb（图）.4种InRNA合成7种病毒蛋白,即外膜蛋白（大、中、主蛋白）、核光蛋白（前C和C蛋白、X蛋白和P蛋白外膜蛋白由S将因区漏玛，包括3种外膜成分：主蛋白（sma1.1.pro1.ein.Sprotein,即HBSAg、中蛋白（midd1.eprotein»Mprotein.即PneS2+HBsAg）和大蛋白（IargCPro（ein,1.protein,即preSI+prcS2+HBsAg）,主蛋白在3种成分中含量最高.主蛋白和中蛋白由Z1.kbmRNA翻译而来，而大Ifi门则是2.4kbmRNA的产物,HBV的外膜蛋白构成病毒的外壳包祇短粒，使病毒能够阴芾和侵入新的细胞“大蛋白在稻毒与细胞受体的结合、病毒颗粘的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外,外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能峪朝激机体产生爱护性免疫应答.核壳蛋白出HBV葩因俎的C区编码，存在两种形式：核心抗原（HBCAg）和渐原（HBeAg）.HBCAg分子量2IKD,是病毒核壳的址成成分,在病毒双制过程中负责对照基因如RNA包装，这是基因组复制的必备步骤.HBCAg仃较强的免段原性,几乎全部的HBV感染者均产生计对HBCAg的抗体-HBCAg是分泌性蛋白,先由PrCC+C区编码带有信号肽的24KD的前体蛋门，前休米臼进入而尔堪体被蛋白假切割后形成16KD成熟分子诳入病人的血液中，HBeAg可选导机体产生相应的抗体，其功能尚不清晰HBCAg和HBeAg均是3,kbmRNA的解译产物，P蛋门即聚合版（po1.ymcrasa.PoD山P基因区端码，是一个含816个氨基酸的大蛋白，也是3.5kbmRNA的翻洋产物,目前已经发觉P蛋门具有4个功能性结构域，P蛋向参加病毒基因组配制的全过程，好个结构域在%因祖复制过程中都发挥不同的作川,HBV前基因狙RNA反转录过程中的几个关键步暇，包括RNA的包装、DNA合成所需的用物、以RNA和DNA为模板介成DNA以及将RNA-DNA杂交体中的RNA消化等,均涉及P蛋白的功能.市于P蛋白的重要性.使其成为抗病毒药物的主要祀点.X蛋白U1.X基因区编码，其转录子为07kbmRNAX蛋臼具有多种功能.它可反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调整序列，还可以激活蛋fI激的C,从而影响细胞信号转导。病毒在体内发制和传播也须要X蛋白的参加"曜"。2.5 HBV的复制在HBV的发制过程中，最突出的特点是，作为DNA病毒，HBV不以DNA为模板进行我制，而是将DNA转乘RNA中间体(RNAmtCnnCdiatC)或称前基因组RNA.再逆发"成DNA进行红制,与逆转录病毒的复制过程类似.HBV的更制过程有以下几个环节1.I侵入：精毒颗粒的外腴蛋白和宿主细恂膜上的受体至今不清晰)结合，脱去外壳核心颗粒进入细胞质,进而脱去核光,病毒DNA及期合梅进入细胞核：2)修复：HBV聚合的修复不完整的正魅,使其与负贷完全互补，形成共价闭合环状DN(cova1.ent1.yc1.osedcircu1.arDN?,cccDNA>.即闻燥旋结构，是物课或知的正要标记；3转录：宿主RNA聚合酹【I以CeCDNA为模板，转录出长短不的mRAN,这些mRNA分子从细胞核转移到细胞而：<4)复制：mRNA分子在细胞质内被翻译成外展、核心、X和聚合陶等多种蛋白.3.5kbmRNA被成为前脸因IHRNA(PRgenomicRNApRNA),含行病毒编码的全部遗传信息，既是蛋白质脑谛的模板，也是HBV基因祖改制时反转录的模板。在细恂质内，核心蛋白包袱PRNA和聚合柝形成新生的核心颗粒,葩毒更制却在其中进行：先由病律自身的塞合陶以PRNA为模板,逆转录出负於DNApRNA被降解：可以负链为模板,合成正鞋DNA.形成部分双Ia的环状DNA,即成熟的病毒族因组；(三)循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒用新进入细胞核，以维持核内礴定量的cccDNA：(6)林放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，袋配好病毒的外壳,形成成熟的病祢煤粒林放到细胞外，国四HBV的红制过程233.HBV的致病性与免疫性乙型肝炎病揖(HCPa1.iIiSBVinIS.HBV)是叨起中国及东南亚一带痰毒性肝炎的主要就原之一,有芈数以上HBV感染的患者将会发展为慢性乙型肝炎(ChrOniCHCPatitis.CH)、肝硬化(1.iverCirrhosis.1.C).拄至肝细胞性In版HCpatOCC1.1.UkH"Carcinoma,HCC),常被形象的称之为“慢性肝病三步曲HBV感染后导致乙型肝炎的致病机制迄今尚未完全阐明.目曲学者们一样认为乙型肝炎病人肝脏损伤弁不是病毒在肝内狂制的干脆结果，而是机体对HBV友达产物的免及导致反应机制所致人体被HBV雪染后,可产生免疫应答反应：<i>体液介导的免及反应：,受乙肝病毒感染后，机体可产生三种抗体,抗HB、抗HBC及抗HBe。抗HBsi股在路染HBV后4周出现，对乙肝有爱护作用，据报道，在医务人员中，有抗HBS者发牛.乙肝的不到1%,而无抗HBS者有11%发生肝炎，但抗HBS仅能作用于细脆外的HBV.在预防它染上较重要,而在疾病复原时尚需细胞免段协同作用.抗HBC的出现反映了HBV新近感染及正在体内进行增殖.因此.它可用为HBV在体内复制的一个指标.抗HBCI般在想染后60150天出现，往往在症状出现前或出现不久后即存在，比抗HBS出现要早3187天，由于抗HBC在疾病复原过程中不仅不上升、反而卜降，因此，认为抗HBC与抗HBS不同,它与爱护无关.而与病毒增殖和肝细胞损害有关.抗Hbe能使病毒活力降低,可能有爱护作用,但机制不一样<2>细恂介存的免及反应：目前认为HBV是非溶细胞性的，即不会增殖裂斛被搜染的细施.因此,机体清除乙肝病毒主要依然Tfff1.施(TC.T杀伤细胞或通过抗体介导的K细胞来杀伤期细胞，物病毒钵放于体液中，以后再经抗体作用,试验探讨发觉,凡转为慢性肝炎者，股T细解数及功能较低下.因此，推想可能乙型肝炎病人T细胞功能强弱与临床过程的轻重和转归有关,DudICUy认为，当T细胞免疫功能正常，受精毒感染的肝细胞不多时，乙肝病毒很快被细胞免疫协作体液免疫予以清除.这时.由细胞免疫所造成的急性肝细胞损伤可完全坡原.如TfH1.胞免疫功能低T,免疫反应不足以完全破坏被病毒感染的肝细胞.或亦不能产生有效的抗HBs,或即使抗HBS却无法作用于细胞内的病毒，持续在肝细胞内的病毒可引起免疫病理反应而导致慢性持续性肝炎.如机体对病毒完全缺乏细胞免校反应，既不能疔效地湎除病毒,亦不导致免疫病理反应,结果出现HBSAg无症状携带症状.假如T细胞免疫功能过强，病毒感染的细胭又过多，细胞免及反应可快速引起大盘肝细胞坏死.临床上表现为暴发性肝炎，但上述学说尚未被完全证明，通过进一步的探讨，多数人认为细恂免疫和体液免疫相"：协作发挥免疫作用.因此,抗体介导的K细版作用已日拄受到重视，并认为是杀伤靶细胞的重要免疫机制.除上述T细胞作用低下外.还有人认为慢性活动性肝炎的发生与T细胞抑制性功能低下，Te细胞或K细胞的杀伤功能过强有关，从而造成肝细胭持续损伤<3)自身免疫反应:HBV感染肝细胞后,一方面可引起肝细胞表面抗原的变更,嶷露山朕上的肝特异蛋白抗原,另一方面可能因HBSAg含有与宿主肝细胞蛋白相同的抗原，从而诙导机体产生对肝细胞腺抗原成份的自身免疫反应。通过探讨，发觉确有就分乙肝病人存在对1.SP的特异抗体或细胞免疫反应。一般认为，如病人在病程中出现F1.q免疫反应.则可加强对肝细胞的损伤而发展成为慢性活动性肝炎.正常人由于T细胞对自身抗体系统的调控，在清除老化或破坏的町细胞时，虽可产生自身抗-6-体.但并不发生自身免疫性疾病.在慢性肝炎,特殊是慢件活动性肝炎时,由于T细胞免疫机能缺陷，乙型肝炎抗原<包括HBSAg.HBcAg及HBvAg)与宿主肝细胞上面或内部的蚩自质相互作用，形成含自身组纵击白的抗原，具有较演的免狡原性，可引起持续的自身免投反应：也可能由于病毒使机体免疫系统稔定性发生紊乱，细恂免疫失去调控,体液免疫反应亢进,对宿主的自身蛆织产生抗体,发生自身组织免疫反应.引起肝细胞畏伤.有探讨表明，慢性活动性肝炎的患者出现对肝细胞发面肝特异性脂蛋白的特异性细胞免疫反应.有人报道，依据肝炎患者肝细胞上免疫球蛋白的沉积，提示存在与HBSAg无关的自身免疫机理。有人认为，肝炎患者病毒性损伤可择放肝特异抗原，使宿主致敬，并使肝损伤持续存在。因此，自身免疫反应在慢性活动性肝炎发薪中具有确定的作用刈。(4)细胞因子介导的免疫机制：虽然HBV特异性CT1.应答对HBV消除起着虫要的作用但肝内CT1.的数目湖杀伤效应远低于能有效限制HBV感染的实力。眼如CT1.通过干脆杀伤效应行效地消除含HBV的肝细胞,则多数乙肝患拧有可能发生大片肝坏死及急性肝衰竭.因此,除了CT1.应答外，其他的机制有可能介导HBV诱发的肝损伤.体内及体外的探讨显示，有些细咆因子可干脆抑制HBV短制。通过加速HBvmRNA的降解抑制HBV的复制，有人报道，mHBV特异性的CT1.产生的IFN-Y及TNF-a可通过非细胞致病效应增加CT1.的抗病布效应，肝内CT1.产生I型致炎性细胞因子,包括，N-Y.I1.-12等.限制肝内的病毒疗染和更制.假如这些细胞因子分泌的不足,则形成慢性感染"新近有多项探讨表明ThIE1.2细胞平衡在HBV感染的结局中起荷关他的作用，CD4+Th细胞(CD4+协助性T细胞可分为ThI和Th2细施.分别介导两种不同的免疫学效应。ThI细胞主要分的I1.2IFN-X和肿痛坏死囚子(TNF)等细胞因子，参加细胞免校应答:Th2细胞主要分泌I1.-4.I1.-5.I1.6和I1.-IO等细胞因子，参加体液免疫应答;，Th2的平衡确定了免疫应答的行效性和平安性。ThI细胞占优势，假向于发生急性自限性感染和HBV清除：而Th2细胞占优势.倾向于发生持续的慢性HBV感染.活化的1111优势反应可以强化充分的HBV特异性CT1.反应.慢性HBv感染者中，HBCAg/HBcAg特异性的ThIEI2细胞平衡被打破(分泌性HBCAg耗娜了Th1.细胞，HBeAg特异性Th2细胞占优势)。体液免疫和细胞免疫反应是被不同的Th细电亚群所询整的：体液免疫主要由Th2细胞调整，细胞免投主要由Th1.细胞调整，Th细胞亚群失衡将严岐扰乱体液免疫和细恂免疫在以模型中视察到影响HBcAg/HBeAgft异性ThhTh2细胞平衡的因素包括网：抗原构成<HBcAg对HBcAg):宿主MHC和T细胞识别位点：Th1.细胞和T1.)2细胞的交互调整分泌性HBCAR对TbI细改的抑制：细胞因子体内治疗使HBV特异性Th细胞亚群反应向ThI或h2倾斜.Q干扰素能流导I1.-12B2亚单位的友达，可以使ThO细胞向ThI细胞分化，这是干扰素调整ThI/Th2细胞平衡的分子机制之一.最新的探讨认为,CT1.在不损伤肝细胞的状况卜也可能清除HBvDNA、核光蛋白和DNA史制中间体，即,非溶细胞性清除机制”.这种作用是通过ThI型细胞因子诱导而实现的，慢性乙型肝炎的复原伴叨若Th1.型细胞因子反应上网.在病毒消除时干扰素水平有显著上升.在黑猩狎.中也发觉HBvDNA水平的下降伴附着干扰素的增加,在“干扰家抗衲毒治疗显现持续反应者中，肝内HBV特异性CD4+T细恂反应和Th1.型细胞因子显著增加存在相关性，外用血淋巴细胞中细胞因子的表达也以ThI型占优势.这说明干扰素的抗病毒效应在很大程度上是通过Th1.型细胞因子而实现的aw14 .乙型肝炎的抗病毒治疗和特异性免疫重建乙型肝炎治疗的目的是减轻肝脏病变，防止或廷缓发展为肝硬化、肝症，最终目标是彻底清除病毒，达到完全治愈,除一般的爱护肝脏和免疫调整治疗外，抗韧毒治疗是肝炎治疗的重点也是难点.到目前为止获得美国食品与药物管理局,FoodandDrugAdministration.EDA）批准并在临床应用的抗HBv药物有两大类：干扰素及核件类似物.它们的代表药物分别是a干扰素（intcrfcron-a,IFN-a）,拉米夫定<1.amivudine,3C）.4.1 。干扰素“干扰素本身是机体细胞因子网络中的IE要组成部分，具有抗病毒、抗细胞.增殖和免疫询整等多种生物活性。干扰素的免疫调整作用包括以下几个方面""1.（1>调整ThIE12细胞平衡，促进ThI优势反应；（2）使CD4/CD8比值发原正常：激活NK细胞的细胞毒作用，增加抗体依*性细胞介导的细胞毒（ADCC）活性：（3）能送导病毒感染细胞表面主要组织相容契合体（MHO-I类抗原友达，有利于CT1.对超染细胞的识别和攻击：（4）能激活抗原提早细胞，增加抗原提呈细脆的功能；（5）能增加巨噬细胞的吞噬功能.诲导择放溶陆体陆：（6>调整细胞因子,如I1.-1.I1.2TNF.有丝分裂因子、巨噬细胞激活因子等的分泌.参加I免疫增加反应，4.2 拉米夫定拉米夫定抑制HBVDNA亚制快速、疗效准确.但拉米夫定的免狡冏整作用并未得到确定。早年的一项探讨认为，拉米夫定可以使血清HBvDNA快速下降，但不能由新发原受投的HBV特异性T细胞反应。最近的探讨认为,拉米夫定可以重批HBV特异性细胞免段在拉米夫定治疗过程中测定T细胞功能时发觉，拉米夫定在大幅度降低病揖和抗原数量的同时，可使长期处于对HBV低反应状态的T细胞功能汨以我原。在祖HBeAg阳性、A1.T上升值独应用拉米夫定的病例中，视察到拉米夫定可以克服慢性HBV感染状态时CT1.低应答状态,使CT1.对外源性刺激敏感。在扪米夫定治疗后714天，可以泅得明显的CD4+T细胞介导的对HBV核壳抗原的反应.这种反应在12例患齐中有IO例呈持续性，其出现继之以快速旦显著的血消病毒水平的下降.伴随潦血清病毒水平的下降，拉米夫定治疗后悔性乙型肝炎患者有效的抗病毒T细胞反应可以得到发原和重建：拉米夫定还可增加T细胞时丝裂原和回忆抗原的反应，说明拉米夫定的效应并不局限于HBV特异性T细恂Wz,依认为“干扰素和拉米夫定治疗显效的近期均不能清除细咆内HBV<xcDNA.秒的后部分病例而单发发，这"双发就例很可能没有建立起充分的抗病Ai免投反应。当充分正规的治疗使抗加再免按反应检固重建后，细恂内HBVaxDNA或许可以清除近年来核昔类药物的研发在国际上很活跋，的希抗病毒弱物的渐渐增多，药物的账合-8-应用为提高疗效和降低耐药供应/可能.5 .乙型肝炎的基因治疗所谓乙型肝炎的基因治疗是指将正常的野生型基因或特定设计的治疗基因导入机体或特定的细胞内静代、修正、补偿有法陷的基因功能：或封闭、抻制异样衣达的基因以达到治疗某种疾病的目的，目前乙型肝炎%因治疗的主要策略包括：反义技术、反战因技术、核解、DNA疫苗、干扰性多肽或蛋白质以及单链抗体等.5.1 反义技术反义技术是指设计与mRNA序列互补的核酸分子，肾入细胞，使其遵循减班配时原则与mRNA特异性位点结合，从而抑制或阻挡蛋白质的翻讲，达到抗精舟的目的“反义技术有反义京'及核核:苗酸(antisenseo1.ig<kxynue1.entide.ASODN)和反义RNA(antisenseRNA).ASoDN是人工合成的由12-30个碱基组成的与和mRNA互补的寐核甘酸片段.它的作用机制包括以下几个方面：(I)ASoDN与耙mRNA结合,形成DNA-RNA杂化分子，阻挡蛋白质的助Iit并诱导RNaSCH降解和mRNA：<2)作用于mRNA5,孤阻挡帽子结构的形成，影响mRNA的成熟；<3>作用于PoIyA的形成位点，阻挡mRNA的成熟及向解浆内转移，由于ASoDN在细胞或体内易被核酸降解失活，为增加其榜定性提高抑制作用，须要对ASoDN进行修饰.现常用的修怖方法包括破代瞬酸化和甲基化.亦有报道用聚乙二胺与ASODN结合可阻挡在体内降蟀,经过修饰后的ASoDN在透媵性和稳定方面都有很大提高.体外探讨很明,针对HBVS、CP、X区聪因的ASoDN均取得相应的抑制效果。反义RNA在细府旗内与塔因的mRNA完全互补，从而阻挡货白质的由IiK5.2 反基因技术与反义技术不同，反聪因技术是依据三蟠旋结构DNA形成的原理，以他基因中同聚映4-嚅唆区域为把位点，设计、合成反基因算核甘酸或二:螺旋形成其核甘酸，导入细胞内,通过与双超DNA形成三螺旋结构.抑制或阻断死基因的转录.5.3 核M(Ribozyme.Rz)核例(Ribozyme.Rz)是一种具有核酸内切解活性的RNA分子,可特异性地与靶基因结合并切割同mRNA.近年来应用RZ已胜利地在细胞内抑制HBV的基因表达“最近.一种什对HBVmRNA的经化学修饰的Rz已羟进入临床试验阶段.5.4 DANJ芟苗(DNAvaccine)DAN疫苗(DNAVaCCinC)又称基因疫苗或核酸度M,是指将编码某特定蛋白质抗原的基因片段插入适当的真核细胞会达我体中，构建心组政粒，然后经肌肉注射或基因枪技术干脆接种到机体中，宿主细胞摄取质粒后，表达抗原蛋白，从而选仔机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,针对HBV的基因疫苗一般选择HBVC区和S区为耙点构妞质粒，诱导机体产生特异性细胞免校和体液免疫应答,达到消除病毒的目的.目前已有批针对HIV、HBV及流感病毒的狡防及治疗型DNA疫苗正在进行临床试验.-9-5.5 负性突变体技术负性突变体技术是通过构建病毒蛋白编码装因的突变体，在细胞内表达异样的新毒蛋白或多肽，从而干扰病毒核酸的包装及病型颗粒的装配.5.6 单链抗体技术单就抗体技术是将目的抗体般因转导把细胞并产生抗体，中和稀原体并抑制其复制的一种治疗方法，有探讨表明,HBsAg的单锥抗体(SingIeChainVariab1.efragrnen1.S.scFv)可使细胞外的HBSAg降低85%.选择抗HBCAS的单培抗体基因在细胞内表达SCFV.通过在细胞内形成抗原-抗体豆合物和干扰HBCAg的功能可抑制病毒红制"*1.6 .常见的几种HBV病毒变异6S基因区变异S基因区包括前S1.、前S2及S苓因.分别编码前SI蛋白、前S2蛋白及主蛋白HBVDNA笫3055核苛酸(nt)约相当于前SI起始码下讷第230城基,可突变形成终止码.并影响1S2起始码.这种突变与HBV能避F扰素治疗和得主免按消除有关。HBVDNA第2995-3177nt位于前S开放读码柢(ORF)内，但其缺失可取相前S的免投性，但仍能保印与肝细胞的结合位点，有利于HBV躲避机体的免疫攻击，形成梭性携带状态在某些病人，HBSAg虽然转阴，但肝功能仍未复原，行相当比例HBAg(一)、抗HBs(+)的患者体内仍可检出HBVDNA,可能绿由有：HBSAg滴度低常规方法不能检出：HBSA匿于HBSAg/抗HBS复合物中：病琮整介后S场因普代突变、跳失或由持；HBV变异株产生变更了HBSAg的抗原反应性，使病毒发生“诊断躲避”.临床上出现的HB3g(+)母亲所生婴儿用乙肝疫苗免疫失败者和原位肝移植受者免疫预防再感染失败者中，大多出现了S在因区变异，从而形成“免疫疑避和投苗殁避J在用高效价乙肝免疫球蛋白(HB1.G)预防HBV再桃染的原位肝移植受者体内检出的S突变株，特殊是笫142.144,145aa二处,包括典缎的“疫苗躲避株”145甘氨酸T精氨酸。这些突变可减弱或变更HBSAg的免按原性，降低HBSAg被HB1.G识别的实力：描除HB1.G后又可回发到野牛.5!，高度提示这些突变是长期免投压力筛选的结果.因而彳!1学者不快同乙肝孕妇在怀孕第7、8、9月注射HBIG以减低新生儿感染率，他们认为这样反而会因过度运用HBIG而导致物祢变界而使阻断失效。但这样的报道尚未有有力数据支持。6.1 前C/C范因变异，C1896位(A83)的变异：前CC班伙1变异,CI896位(A83)的变异是HBV中G常见的变异。野毒株1896位是G,交界为A,A83第基酸TGC变异为终止密码(TAG),使前C蛋白的(W谛终止,从而使eAg不能合成，此突变有助于HBV舰遇开枝攻击但它并不影响报道亚制,而形成慢性尊染状态.这种状况临床上衣现为HBCAg(一)、HBV-DNA(+),而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎.即未经药物治疗的小三阳但HBVDNA阳性者。上述变异也见于干扰素治疗后，因此提示以HBeAg转阴作为疾病好转的指标有时并不精确，结合HBvgNA依测推断叫。63P法因区变异-10-P%因区编码HBVDNA聚合险(DNAP卜其白然突变率与逆转录病毒gag基因相近，第2798ntA-C可使DNAP中的一个肺电酸由苏会酸取代，导较HBV复制缺陷.目前临床上广泛运用的胞件类似物拉味味脆(IamiVUdinc)和巧首类似物泛普洛韦(famcic1.ovir)等抗HBV药物,作用靶位主要是DNAP,通过与底物dNTP竞争结合以抑制HBV的逆转录和复制，但这些药物的运用产生了HBV的耐药突变株，而形成了“抗精用治疔躲避”.HBV耐药株的突变就发生在DNAP基因内,DNAP催化中心核首酸结合位区为一也度保守序列，即略氨饿(Y)、蛋氨饿(M).大冬氮侬(Dr基序(YMDDmOtiD.是DNAP发挥催化活性所必肯的关犍结构,发生突变以后可能使已降低的病情加剧(叩所谓反跳),对所用药物产生耐受.YMDD耐药变异的防治：1.着用药时间的延长，核仔类的物易引起物毒变异，导致耐的，为了削减耐药性的出现,可以联合用药.从理论上讲干扰素和核普类药物在不同的肥位点联合附用.可削诚耐药株的出现.阿镌福韦是一个广谱的抗病毒药物.在HIV治疗过程中未发觉有耐药变异.全部变异株对阿他福韦均敏感，旦对联合变异也有效6.4 X基因区变异X基因是病毒或制的由要时整区，是转录、反转录和正能合成的起点，也是多种细胞囚产结合戊，此区变异影响到病毒的转录和夏禽前认为X培因区BCP、SP或PIeSP的变异变更/HBV基因表达的平衡，IjHBV持续感染相关.这种变异株的HBSAg.HBcAg.HbCAg表达水平均下降.但DNA水平与野生株相仿或稍高，提示病毒复制实力变更不大：将后一变好株与少收完整的X然因共转染细胞，则HBCAg产笊比单纯变井株多3倍，但CabNrizO等报道HBvoRFX变异可能也是某些患者体内HBVDNA水平较低、病毒生物活性减弱的个绿IIIHBXAg也可旎成为致敬CT1.攻击的把抗原.患者肌清中可溶性HBXAg相关多肽可调整CTUj靶细胞的免及识别,因此ORF-X变弁可能亦不利于清除HBV.另一方面，HBXAg是一种强力反式激活因子,可通过多种途径促发肝细胞癌变I刈.7 .乙型肝炎探讨的细胞模型建立表达乙型肝炎捕母的体外培科细胞模蟹,对探讨IIBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选及致癌机制的探讨有重要意义.7.1 肝源细胞系肝脏是HBV感染和发制的主要场所，故肝细胞是HBv礴染校鞭的首选细胞，目前应用于HBv培育的细胞系有成人肝细胞系、胚胎肝细胞系和肝癌细胞系,尤其是肝癌细胞系.如IHCpG2,Huh6-C5,Huh-7.Hcp3B.P1.CPR日5等，在HBVDNA及其基因组片段的转染细胞系的建立中占有重要的地位。<1)成人肝细胞模里:用含HBv影染脓粒的人血清接种培育的成人肝细胞，可在上消中检测到HBv抗原和HBVDNA,表明HBV可感染原代培育的成人肝细胞,同时用PrCS1.特异性抗血清能阻断病毒感染.川在含2%：甲亚巩(DMS0)培育液中加入聚乙二解可显E增加HBvDNA内吞Jft和提高病毒的吸附效率而不变更HBV感染的祖织及种特片性,HBV总案成人肝细胞模型与自然感染过程相像,病毒抗原可较长时间存在,细恂内出现HBvDNA更制型.但成人肝细胞是一类终末分化的细苑.不能传代培育,且在肝细胞惆板后,成熟肝细施的功能如白蛋白产生实力下降、失去典型多角形态.对病毒敏感性也渐渐下降,限制其实际应用.-11-(2)胚胎肝细胞模型:人胎肝细胞系可较好模拟人体内肝细恂的生物学功能,并对血清HBV感染圾出.产生HBV红制型和各种病毒标记物择放DanC颗粒.来自不同船龄的胎肝细胞对HBV感染显示相同的感杂动力学,但成熟的原代胎肝细胞体外长期培育特别困难.细胞分化实力有限，不能多次传代，且胎肝细胞的分化状态时病毒双制可能产生影响，限制了其应用和探讨。<3)HePaRG细胞株:由于用血清干脆感染细胞更接近自然感染状态.适用于探讨在自然条件下病揖吸附、穿入宿主细胞的机制，及抗体的中和作用、抗病毒治疗等,而过去所建立的肝痕细胞,株无法干脆用病人血清能染。PhiIiPPeGiiPon等1121从慢性丙型肝炎盛染的肝牖病人体内分别，加入DMSo和类皮质激素培仔，建立的HCPaRG肝牖细胞株.HePaRG细胞株与正常的肝细胞相比具有相像的形态学和生理学功旎,既可用于转染,乂和原代肝细胞一样适合于HBV血清干脆感染，从培育上消中可检测到HBV抗除和HBVDNA.而只该细胞株具行与正行人肝细胞相像的生物学特性，可以应用于探讨病毒感染的早期阶段包括仍旧未知的病毒分子受体、药物对嵇毒感染早期阶段的作用、抗摘毒药物的筛选、药物的毒理学和药理学在内的很多领域.7.2 非肝源细胞系1980年以来,接连在肝外组织如腺、肾且工、骨的淋巴样母细也和外周血单个核细胞等中发觉了HBvDNA及其基因产物.并且可作为HBV感染复发的重要来源.提小HBV除了用细胞外,还彳I泛唔性，这是将其肝源细胞列入转染肥细胞的通要依据.目前用于HBvDNA转染的非肝源性细胞系彳OF1.SIHeIa细胞、单个核细胞系U937细府、树突状细胞等，这些细恂系可表达病态的全部或部分抗原、HBVDNA,表明其内环境可支持HBV及制、包装和分灌.HBV基因在U937和树突状细胞中胜利表达对探讨HBV红制机理、在骨骼来源的细胞系中的圜整、免及系统对HBV的影响等特别有用.但非用脏细胞:装配和分泌的HBV瑕粒，只是类似Tf1.然状态的HBV病毒颗粒，9真正自然状态的HBV领粒右很大差别，7.3 动物细胞系很多探讨表明，HBV可在动物细胞系中狭得短管或较匕时间的发达.DCMCyCr创414探讨表明HBVS基因去达的小蛋白(SP)能与Ca'依靠性磷脂结合蛋白(humanannexinV)特异性结合,促进HBV进入大副原代肝细胞反制并进行表达，介导HBv的种属特异性感染.在动物细咆系中的胜利转染表明HBV感型的种属屏障在于其M犯细胞细胞膜的吸附及透过,而HBV的复制和友达则依靠于肺细胞内环境.此外，小以成纤维细胞系NIH3T3和1.tK、大仪MorriS肝癌细胞系Q7、果蝇细胞、非洲绿默忏细招Veg等，也常被选为转集犯细艇，可表达HBV的抗原和分泌病毒颗粒IIBV在非人类细帼内处制的细胞模型可作为在人类细胞内U制模型的补充叱7.4 展望HBV细胞模型矩筛选抗HBV药物、探时HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具.己有的细胞模型在探讨HBV发病机理、免疫机制、抗病毒药物的筛选中发挥了确定的作用，但也存在问题：(1)无时病毒感染和致梆机理合适的细恻模型：-12-(2)细胞表达的稳定性问遨.今后建立的细胞模型应借助于分子生物学、分子细胞学的最新进展,找寻既适用于传染,又可用血清干脆感染.接近肝细胞生理状态并能稳定表达HBv抗原的细胞模型，将时探讨HBV的生物学特性、感染姆制、抗病毒约物的筛选和致癌机制有重要帮助，参考文献1 .跳光弼等.的床卅脏病学.上海科学技术出版社2 .Y(n£Suk1.n.1.>gJinSuh.Cunvn1.AnhvindIherupyfurChmntcHeIm1.Ii'B.JKoreanMedSci.2<XM:19:4S9-494.3 .切赤性肝炎1.¾治方窠.中华传柒病杂志,2001.19:5662.4 .谢夫恩胡志红一般病毒学.科学出版社.20025 .Kozie1.MJ.Cy1.okinexinvira1.hePatiIiVSemin1.ivwDis.1999.19:)57-169.6 .阿KKf现代医学微生物学.JJh上窗医科高校出版社,1999,105370677 .姚光蜴.等.幅床肝脏病学第版.上褥:一卜海科学技术出皈社.&中华医学会传染病与寄生小学分公、肝病学分公病毒忤阳炎防治方案.传逐病行总213:I3MX9.王滨右病毒与他康$,化学工业出版社，200410.金曲侯学分子物毒学，北京，科学出版社,2001.762-785I1.任向来RNA干状抑IWHBVa(白溜达和病穹便制的探讨.中山恋校博士学位论文,2004IIOeIX何建文、何丽芳、解忻等乙型肝炎病毒全基因组探讨