乙肝病毒特性与致病机理研究进展.docx

乙肝病毒特性与致病机理探讨进展王晓冬，土峰，吕月蒙，李强，张国峰，孙涛，贾亚雄甘肃农业高校生命科学技术学院，甘肃竺州(730070)E-mai1.：摘要：乙型肝炎痛毒(HePatitiSBVirus,HBV)是引起中国与东南亚带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性肝炎(ChroniCHepatitis,CH)、肝硬化(1.iVerCinhosis,1.C),甚至肝细胞性IfI癌(HePatoCeuUIarCarcinoma,HCC),常被形象的称之为“慢性肝病三步曲”。新近有多项探讨表明活化的T细胞反应可能在HBV感染的慢性化和肝细胞损伤过程中起重要作用。CD4+Th细胞可分为Th1.和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。Th1.细胞主要分泌I1.-2,IFN-X和肿病坏死因子(TNF)等细胞因子，参加细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌I1.-4,I1.-5,I1.-6和I1.-Io等细胞因子，参加体液免疫应答;Th1./Th2的平衡确定免疫应答的有效性和平安性。ThI与Th2之间存在相互制约或促进左右，细胞因子组成个困难的分子网络，参加调整炎症反应以与器官功能的自我稳定。关键词：细胞因子，乙型肝炎病毒，细胞毒性T淋巴细胞1 .引言乙型病毒性肝炎(hepatitisB,HB)是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)引起的。HBV的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化(HVerCi1.Thosis,1.C)和肝细胞癌(hepatoce1.1.u1.arcarcinoma,HCC）的发生、发展亲密相关。20%的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危急性是正常人的100倍。HBV感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg）携带率在2%以下；东欧、日本、前美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东前亚与南非为岛流行区（HBSAg携带率10%左右）。全世界共有约3.5亿人为HBSAg慢性携带者，其中3/4在亚洲。HBV感染导致全球每年50120万人死亡，其中死于Hee的约占32万。我国是HBV感染的高发区，约60%的人群感染过HBV,10%的人群为携带者，多达1.2亿。现花乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为158/10万'11.随着HBV疫苗在1982年的问世，HBV感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了确定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍旧不容乐观，现有乙型肝炎患者与带毒者数敬浩大，面临发展为肝硬化和肝癌的危急，不幸的是，到目前为止，还没有针对HBV的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍旧是一个严峻的问题，找寻更有效的治疗途径是医学探讨的重大课题。2 .HBV的生物学特性2.1 HBV的生物学分类1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV划归为个新的病毒科一嗜肝DNA病毒科（HePadnaViridae）的成员C该科病毒成员除了人HBV外还有：（】）东方上拨鼠肝炎病毒（GHV）,1978年在美国新泽西州和马里丝州等地的野生土拨鼠发觉该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV）,是1980年在美国南加州的地松鼠中发觉的；（3）鸭乙型肝炎病毒（DHBV）,1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分别自易发生肝癌的麻鸭，后来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发觉此病毒s22.2 HBV的形态与结构-1-HBV在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗粒，电镜卜.视察HBV的提纯制品，证明有三种类型颗粒1.小球型颗粒平均直径为22nm,由空心病毒包膜组成，是HBV多余的衣壳蛋白，没有病毒核酸。无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具彳丁中和病毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。2.管型颗粒由小球型颗粒连接而成，其长短不一。小球型颗粒和管型颗粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩“小球型颗粒和管型颗粒与DanC颗粒的比例依不同的病程差异较大，一般撒Dane颗粒的10410”倍，在患者血液中的含量可高达1。"个/m1.3Dane颗粒为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为42nm,由包膜和核衣壳组成。核衣壳直径为27nm,含有HBcAg,单一分子的部分双链DNA以与依轴DNA的DNA聚合解C核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的爱护性容器C另一独特的特征是P蛋白与长DNA锌共价结合。在患者血液中的Dane颗粒含成为1(106m1.图一电子显微镜下可以视察到乙肝病毒3种不同的形态：大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒"3-2-图二肝病毒(HBV)结构示意图102.3 理化特性与反抗力在气化钠平衡梯度高心中,HBV颗粒(42nm)的浮力为122gc11?.表面抗原颗粒(22nm)为1.22gcm痛毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的30%。HBV对理化因素有较强的反抗力。病毒在3032C可存活至少6个月，在-20C可存活15年。病毒浓度高时，60C加热IOh,或98C加热Imin,以与乙醍或pH204处理均不能有效灭活乙肝病毒，能够灭活HBV的常用方法和条件包括121C高压灭曲20min,160C干烤1.h,100C干脆煮沸2min,以与0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的干脆处理。HBV的感染性并非与其抗原性和免疫原性相一样，在一些能够灭活HBV感染性的条件下，共抗原性和免疫原性-仍可较好保留2.4 HBV的基因组和蛋白蛆成HBV基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负(一)链为全长基因，约含3200个核甘酸，而正(+)链是负链K度的2080%,病毒颗粒内含方DNA聚合醉。在全部已知可感染人体而且具方独立复制实力的双链DNA病毒中，HBV基因组是最小但乂是最高效的。它具有以卜注个显明的特点”(1)不完全双链环状结构；(2)利用重叠的开放读码框(openreadingframeORF)编码多个蛋白质;(3)全部调控序列均位于蛋白质编码区内;(4)基因序列具有多变性。-3-图三HBV基因组基本结构15HBV含有4个ORF,即S区(包括preS1.、preS2与S)、C区(包括PreC和C)、P区和X区“TORF之间相互重强。HBV有4种转录子，共用一个PoIyA加尾信号，长度分别为3.5kb、24kb21.k1.07kb(?!)。4种mRNA合成7种病毒浅白，即外膜假白(大、中、主蛋白)、核壳能白(前C和C蛋白)、X蛋白和P蛋白”支外膜浅白由S基因区编码，包括3种外膜成分：主维门(sma1.1.Protein,Sprotein,即HBSAg)、中蛋白(midd1.eprotein,Mprotein,即preS2+HBsAg)和大柒白(1.argeprotein,1.protein,即preS1.+preS2+HBsAg),主蛋白在3种成分中含成及高。主蛋白和中蛋白由2.1kbmRNA翻译而来，而大蛋白则是2.4kbmRNA的产物，HBV的外膜蛋白构成病毒的外壳包袱颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞,大蛋日在病毒与细胞受体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外，外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能够刺激机体产生爱护性免疫应答。核壳蛋白由HBV基因组的C区编码,存在两种形式:核心抗原(HBCAg)和e抗原(HBeAg).HBcAg分子量21KD,是漏毒核壳的组成成分，在病毒复制过程中负责对前基因组RNA包装，这是基因组复制的必备步骤。HBCAg有较强的免疫原性，几乎全部的HBV感染者均产生针对HBCAg的抗体。HBeAg是分泌性蛋白，先由preC+C区编码带有信号肽的24KD的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基体被蛋白施切割后形成16KD成熟分子进入病人的血液中，HBeAg可诱导机体产生相应的抗体，其功能尚不清晰。HBCAg和HBeAg均是3.5kbmRNA的翻译产物。P蛋白即聚合醐（P。IymeraSa,Po1.）由P基因区编码，是一个含816个负基酸的大能白，也是3.5kbmRNA的翻译产物。目前已经发觉P蛋白具有4个功能性结构域，P蛋白参加病毒基因蛆复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作用。HBV前基因组RNA反转录过程中的几个关键步骤，包括RNA的包装、DNA合成所褥的引物、以RNA和DNA为模板合成DNA以与将RNA-DNA杂交体中的RNA消化等，均涉与P蛋-4-白的功能。由于P蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要把点CX蛋白由X基因区编码，其转隶子为07kbmRNA°X蛋白具有多种功能。它可反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调整序列，还可以激活浅白激陶C,从而影响细胞信号转导。病毒在体内复制和传播也须要X蛋白的参加。2.5 HBV的复制在HBV的复制过程中，最突出的特点是，作为DNA病毒，HBV不以DNA为模板进行复制，而是将DNA转录RNA中间体(RNAintermediate)或称前基因组RNA,再逆转求成DNA进行复制，与逆转隶病毒的豆制过程类似。HBV的纪制过程有以下儿个环节,沟：(1)侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜上的受体(至今不清晰)结合，脱去外壳核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒DNA与聚合醐进入细胞核；(2)修身：HBV聚台懒修品不完整的正徒，使其与负链完全互补，形成共价闭合环状DNA(cova1.ent1.yc1.osedcircu1.arDNA1cccDNA),即超螺旋结构，是病毒复制的重要标记；(3)转聚：宿主RNA聚合fiH以CCCDNA为模板，转隶出长短不的mRAN,这些mRNA分子从细胞核转移到细胞质；(4)复制：mRNA分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X和聚合隧等多种蛋白。3.5kbmRNA被成为前基因组RNA(pregenomicRNA,pRNA),含有病毒编码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是HBV基因组复制时反转录的模板。在细胞质内，核心蛋白包袱PRNA和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复制即在其中进行：先由病毒自身的聚合能以PRNA为模板，逆转录出负链DNA,PRNA被降解：再以负链为模板，合成正链DNA,形成部分双链的环状DNA,即成熟的病毒基因组;(5)循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持核内确定量的CCCDNA;(6)释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳，形成成熟的病毒颗粒稀放到细胞外。图四HBV的复制过程23-5-3.HBV的致病性与免疫性乙型肝炎病毒(HePatitiSBVirus,HBV)是引起中国与东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性乙型肝炎(ChroniCHePatitiS,CH)、肝硬化(1.iVerCirrhoSiS,1.。，旄至肝细胞性If啕(HePat。CeIIU1.arCarcinoma,HCC),常被形象的称之为“慢性肝病三步曲HBV感染后导致乙型肝炎的致病机制迄今尚未完全阐明。目前学者们一样认为乙型肝炎病人肝脏损伤并不是病毒在肝内复制的F脆结果，而是机体对HBV表达产物的免疫导致反应机制所致洌。人体被HBV感染后，可产生免疫应答反应：(1)体液介导的免疫反应：受乙肝病毒感染后，机体可产生三种抗体，抗HBs、抗HBC与抗HBe。抗HBS一般在感染HBV后4周出现，对乙肝有爱护作用。据报道，在医务人员中，有抗HBS者发生乙肝的不到1%,而无抗HBS者有11%发生肝炎。但抗HBS仅能作用于细胞外的HBV,在预防感染上较重耍，而在疾病复原时尚需细胞免疫协同作用。抗HBC的出现反映了HBV新近感染与正在体内进行增殖，因此，它可用为HBV在体内更制的一个指标。抗HBC搬在感染后60150天出现，往往在症状出现前或出现不久后即存在，比抗HBS出现要早3187天，山于抗HBC在疾病复原过程中不仅不上升、反而下降，因此，认为抗HBC与抗HBS不同，它与爱护无关，而与病毒增殖和肝细胞损害有关。抗Hbe能使病毒活力降低，可能有爱护作用，但机制不样I均。(2)细胞介导的免疫反应：H前认为HBV是而溶细胞性的，即不会增殖裂解被感染的细胞.因此，机体清除乙肝病毒主要依野T细胞(TC,T杀伤细胞)或通过抗体介导的K细胞来杀伤靶细胞，将病毒释放于体液中，以后再经抗体作用。试验探讨发觉，凡转为慢性肝炎者，一股T细胞数与功能较低卜°因此，推想可能乙型肝炎病人T细胞功能强弱与临床过程的轻重和转回有关。DUdIeUy认为，当T细胞免疫功能正常，受病毒感染的肝细胞不多时，乙肝病毒很快被细胞免疫协作体液免疫予以清除，这时,由细胞免疫所造成的急性肝细胞损伤可完全复原。如T细胞免疫功能低下,免液反应不足以完全破坏被病毒感染的肝细胞，或亦不能产生有效的抗HBs,或即使抗HBS却无法作用于细胞内的病毒，持续在肝细胞内的病毒可引起免疫病理反应而导致慢性持续性肝炎。如机体对病毒完全缺乏细胞免疫反应，既不能方效地清除病毒，亦不导致免疫病理反应，结果出现HBsAg无症状携带症状。假如T细胞免疫功能过强，病毒感染的细胞乂过多，细胞免疫反应可快速引起大量肝细胞坏死，临床上表现为暴发性肝炎。但上述学说尚未被完全证明，通过进一步的探讨，多数人认为细胞免疫和体液免疫相互协作发挥免疫作用。因此，抗体介导的K细胞作用已日益受到重视，并认为是杀伤靶细胞的重要免疫机制。除上述T细胞作用低下外，还方人认为慢性活动性肝炎的发生与T细胞抑制性功能低下，TC细胞或K细胞的杀伤功能过强有关，从而造成肝细胞持续损伤(3)自身免疫反应：HBV感染肝细胞后，一方面可引起肝细胞表面抗原的变更，暴露出膜上的肝特异蛋白抗原，另一方面可能因HBSAg含有与宿主肝细胞送白相同的抗原，从而诱导机体产生对肝细胞膜抗原成份的自身免疫反应。通过探讨，发觉确有部分乙肝病人存在对1.SP的特异抗体或细胞免疫反应。一般认为，如病人在痛程中出现自身免疫反应，则可加强对肝细胞的损伤而发展成为慢性活动性肝炎,正常人由于T细胞对自身抗体系统的调控，在清除老化或破坏的肝细胞时,虽可产生自身抗-6-体，但并不发生自身免疫性疾病.在慢性肝炎，特殊是慢性活动性肝炎时，由于T细胞免疫机能缺陷，乙型肝炎抗原(包括HBsAg,HBcAg与HBeAg)与宿主肝细胞表面或内部的能白质相互作用，形成含自身组织能白的抗原,具有较强的免疫原性，可引起持续的自身免疫反应；也可能由于病毒使机体免疫系统稳定性发生紊乱，细胞免疫失去调控，体液免疫反应亢进，对宿主的自身组织产生抗体，发生自身组织免疫反应，引起肝细胞损伤。有探讨表明，慢性活动性肝炎的患者出现对肝细胞表面肝特异性脂蛋白的特异性细胞免疫反应。有人报道，依据肝炎患者肝细胞上免疫球蛋白的沉积，提示存在与HBSAg无关的自身免疫机理C有人认为，肝炎患者病毒性损伤可群放肝特异抗原，使宿主致敬，并使肝损伤持续存在。因此，自身免疫反应在慢性活动性肝炎发病中具布确定的作用网。(4)细胞因子介导的免疫机制：虽然HBV特异性CT1.应答对HBV清除起着重要的作用但肝内CT1.的数目湖杀伤效应远低于能有效限制HBV感染的实力。假如CT1.通过干脆杀伤效应有效地清除含HBV的肝细胞，则多数乙肝患者有可能发生大片肝坏死与急性肝衰竭。因此，除了CT1.应答外，其他的机制有可能介导HBV诱发的肝损伤。体内与体外的探讨显示，有些细胞因子可干脆抑制HBV复制。通过加速HBVmRNA的降解抑制HBV的豆制，有人报道，由HBV特异性的CT1.产生的IFN-Y与TNF-a可通过非细胞致病效应增加CT1.的抗病毒效应。肝内CT1.产生I型致炎性细胞因子，包括IFN-Y,I1.-12等，限制肝内的病毒感染和复制。假如这些细胞因子分泌的不足，则形成慢性懑染困)新近有多项探讨表明Th1.Th2细胞平衡在HBV感染的结局中起着关健的作用。CD4+Th细胞(CD4+协助性T细胞)可分为Th1.和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应CThI细胞主要分泌I1.-2,IFN-X和肿痛坏死因子(TNF)等细胞因子，参加细胞免疫应答;Th2细胞生要分泌I1.-4,I1.-5,I1.-6和I1.-IO等细胞因子，参加体液免疫应答;ThI/Th2的平衡确定了免疫应答的有效性和平安性CThI细胞占优势，倾向于发生急性自限性感染和HBV清除；而Th2细胞占优势，倾向于发生持续的慢性HBV感染。活化的Th1.优势反应可以强化充分的HBV特异性CT1.反应。慢性HBV感染者中，HBCAg/HBeAg特异性的Th1./Th2细胞平衡被打破(分泌性HBeAg耗竭了ThI细胞，HBeAg特异性Th2细胞占优势)。体液免疫和细胞免疫反应是被不同的Th细胞亚群所调整的：体液免疫主要由Th2细胞调整，细胞免疫主要由ThI细胞调整。Th细胞亚群失衡将严竣扰乱体液免疫和细胞免疫(32-34O在鼠模型中视察到影响HBcAg/HBeAg特异性ThI/Th2细胞平衡的因素包括I冽：抗原构成(HBcAg对HBeAg);宿主MHC和T细胞识别位点；Th1.细胞和Th2细胞的交互调整分泌性HBeAg对ThI细胞的抑制；细胞因子体内治疗使HBV特异性Th细胞亚群反应向Th1.或Th2倾斜。Q干扰素能诱导I1.-1202亚单位的表达，可以使Tho细胞向Th1.细胞分化，这是干扰素调整Th1./Th2细胞平衡的分子机制之一。用新的探讨认为,CT1.在不损伤肝细胞的状况下也可能清除HBVDNA、核壳蛋白和DNA豆制中间体，即“非溶细胞性清除机制”°这种作用是通过Th1.型细胞因子诱导而实现的，慢性乙型肝炎的史原伴随着Th1.型细胞因子反应上调，在病毒清除时Y干扰索水平有显著上升。在黑猩猩中也发觉HBVDNA水平的下降伴随着Y干扰素的增加。在干扰素抗病毒治疗显现持续反应者中，肝内HBV特异性CD4+T细胞反应和Th1型细胞因子显著增加存在相关性，外周血淋巴细胞中细胞因子的表达也以Th1.型占优势,这说明干扰素的抗病毒效应在很大-7-程度上是通过Th1型细胞因子而实现的加"网。4.乙型肝炎的抗病毒治疗和特异性免疫重建乙型肝炎治疗的目的是减轻肝脏病变，防止或延缓发展为肝硬化、肝癌，最终目标是彻底清除病毒，达到完全治愈。除一般的爱护肝脏和免疫调整治疗外，抗病毒治疗是肝炎治疗的重点也是难点。到目前为止，获得美国食品与药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准并在临床应用的抗HBV药物有两大类：干扰素与核甘类似物，它们的代表药物分别是a干扰素(interferon-a,IFN-a),391拉米夫定(1.amiVUdine,3CT)04.1 干扰素a干扰素本身是机体细胞因子网络中的重要组成部分，具有抗病毒、抗细胞增殖和免疫调整等多种生物活性。a干扰素的免疫调整作用包括以卜几个方面“皿”：(1)调整Th1.Th2细胞平衡，促进Th1.优势反应；(2)使CD4/CD8比值更原正常；激活NK细胞的细胞毒作用，增加抗体依靠性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性；(3)能诱导病毒感染细胞表面主要组织相容更合体(MHe)-I类抗原表达，彳利于CT1.对感染细胞的识别和攻击；(4)能激活抗原提呈细胞，增加抗原提呈细胞的功能；(5)能增加巨噬细胞的吞噬功能，诱导释放溶的体的；(6)调整细胞因子，如I1.-1、I1.-2、TNFx有丝分裂因子、巨噬细胞激活因子等的分泌，参加免疫增加反应。4.2拉米夫定拉米夫定抑制HBVDNA复制快速、疗效准确。但拉米夫定的免疫调整作用并耒得到确定。早年的一项探讨认为，拉米夫定可以使血消HBVDNA快速下降，但不能重新复原受损的HBV特异性T细胞反应。最近的探讨认为，拉米夫定可以重建HBV特异性细胞免疫在拉米夫定治疗过程中测定T细胞功能时发觉，拉米夫定在大幅度降低病毒和抗原数量的同时，可使长期处于对HBV低反应状态的T细胞功能得以复原C在一组HBeAg阳性、A1.T上升单独应用拉米夫定的病例中，视察到拉米夫定可以克服慢性HBV感染状态时CT1.低应答状态，使CT1.对外源性刺激敏感。在拉米夫定治疗后714天，可以测得明显的CD4+T细胞介导的对HBV核壳抗原的反应，这种反应在12例患者中有10例呈持续性，其出现继之以快速且显著的血清病毒水平的下降。伴随着血清病毒水平的下降，拉米夫定治疗后慢性乙型肝炎患者有效的抗病毒T细胞反应可以得到复原和重建;拉米夫定还可增加T细胞对丝裂原和回忆抗原的反应，说明拉米夫定的效应并不局限于HBV特异性T细胞H"般认为干扰素和拉米夫定治疗显效的近期均不能清除细胞内HBVCCCDNA,停药后部分病例简单复发，这些复发病例很可能没有建立起充分的抗病毒免疫反应。当充分正规的治疗使抗病毒免疫反应稳固重建后，细胞内HBVCCCDNA或许可以清除“支近年来核首类药物的研发在国际上很活跃，随着抗病毒药物的渐渐增多，药物的联合-8-应用为提高疗效和降低耐药供应r可能。5 .乙型肝炎的基因治疗所谓乙型肝炎的基因治疗是指将正常的野生型基因或特定设计的治疗基因导入机体或特定的细胞内替代、修正、补偿有缺陷的基因功能；或封闭、抑制异样表达的基因以达到治疗某种疾病的目的。目前乙型肝炎基因治疗的主要策略包括：反义技术、反基因技术、核悔、DNA疫苗、干扰性多肽或蛋白质以与单能抗体等“5.1 反义技术反义技术是指设计与mRNA序列互补的核酸分子，导入细胞，使其遵循碱层配对原则与mRNA特异性位点结合，从而抑制或阻挡蛋白质的翻译,达到抗病毒的目的。反义技术有反义寡聚核糖核甘酸(antisenseO1.igodcxynuc1.eotide,ASoDN)和反义RNA(antisenseRNA)0ASODN是人工合成的由1230个碱基组成的与靶mRNA互补的寡核甘酸片段。它的作用机制包括以下几个方面：(1) ASoDN与靶mRNA结合，形成DNA-RNA杂化分子，阻挡蛋白质的翻译，并诱导RNaSeH降解耙mRNA;(2)作用于mRNA5'端，阻挡帽子结构的形成，影响mRNA的成熟；(3)作用于PoIyA的形成位点，阻挡mRNA的成熟与向胞浆内转移。由于ASoDN在细胞或体内易被核酸降解失活，为增加其稳定性提高抑制作用，须要对ASODN进行修饰。现常用的修饰方法包括硫代磷酸化和甲基化，亦有报道用聚乙二胺与ASoDN结合可阻挡在体内降解。经过修饰后的ASODN在透膜性和稳定方面都有很大提高。体外探讨表明，针对HBVS、C、P、X区基因的ASODN均取得相应的抑制效果。反义RNA在细胞质内与基因的mRNA完全互补，从而阻挡蛋白质的翻译。5.2 反基因技术与反义技术不同，反基因技术是依据三螺旋结构DNA形成的原理，以和基因中同聚嗦吟-嗡噬区域为网位点，设计、合成反基因寡核甘酸或三螺旋形成寡核甘酸，导入细胞内，通过与双健DNA形成三螺旋结构，抑制或阻断靶基因的转录。5.3 核能(Ribozyme,Rz)核酶(Ribozyme,Rz)是一种具方核酸内切懒活性的RNA分子，可特异性地与靶基因结合并切割靶mRNA。近年来，应用RZ已胜利地在细胞内抑制HBV的基因表达。最近，一种针对HBVmRNA的经化学修饰的RZ已经进入临床试验阶段。5.4 DAN疫苗(DNAvaccine)DAN疫苗(DNAVaCCine)又称基因疫苗或核酸疫苗，是指将编码某一特定蛋白质抗原的基因片段插入适当的真核细胞表达载体中，构建重组质粒，然后一经肌肉注射或基因枪技术F脆接种到机体中，宿主细胞摄取质粒后，表达抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答C针对HBV的基因疫苗一般选择HBVC区和S区为阳点构建质粒，诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答，达到清除病毒的目的。目前已有一批针对HIV、HBV与流感病毒的预防与治疗型DNA疫苗正在进行临床试验。-9-5.5 负性突变体技术负性突变体技术是通过构建病毒蛋臼编码基因的突变体，在细胞内表达异样的病毒蛋白或多肽，从而干扰病毒核酸的包装与病毒颗粒的装配。5.6 单模抗体技术单链抗体技术是将目的抗体基因转导靶细胞并产生抗体，中和病原体并抑制其复制的一种治疗方法。有探讨表明，HBSAg的单链抗体(sing1.echainvariab1.efragments,scFv)可使细胞外的HBSAg降低85%。选择抗HBCAg的单镂抗体基因在细胞内表达scFv,通过在细胞内形成抗原-抗体史合物和干扰HBCAg的功能可抑制病毒更制”闾。6 .常见的几种HBV病毒变异6.1 S基因区变异S基因区包括前S1、前S2与S基因，分别编码前S1.蛋白、前S2蛋白与主蛋白。HBVDNA第3055核甘酸(nt)约相当于前S1.起始码下游第230碳基,可突变形成终止码，并影响前S2起始码，这种突变与HBv躲避干扰素治疗和宿主免疫清除有关。HBVDNA第2995-3177nt位于前S开放读码框(ORF)内，但其缺失可减弱前S的免疫性,但.仍能保留与肝细胞的结合位点,方利于HBV躲避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态W在某些病人，HBSAg虽然转阴，但肝功能仍未复原，有相当比例HBSAg(一)、抗HBs(+/-)的患者体内仍可检出HBVDNA,可能缘由有：HBSAg滴度低，常规方法不能检出;HBSAg隐匿于HBSAg/抗HBS复合物中；病毒整合后S基因替代突变、缺失或垂排；HBV变异株产生变更了HBSAg的抗原反应性，使病毒发生“诊断躲避”。临床上出现的HBSAg(+)母亲所生婴儿用乙肝疫苗免疫失败者和原位肝移植受者免疫预防再感染失败者中，大多出现了S基因区变异，从而形成“免疫躲避和疫苗躲避”。在用高效价乙肝免疫球景白(HB1.G)顼防HBV再感染的原位肝移植受者体内检出的S突变株，特殊是第142,144,145aa二处，包括典型的“疫苗躲避株”145甘刎酸T精妃酸。这些突变可减弱或变更HBSAg的免疫原性，降低HBSAg被HBIG识别的实力；撤除HBIG后又可同复到野生型，高度提示这些突变是K期免疫压力筛选的结果。因而有学者不赞同乙肝孕妇在怀孕第7、8、9月注射HBIG以减低新生儿感染率，他们认为这样反而会因过度运用HB1.G而导致病毒变异而使阻断失效。但这样的报道尚未有有力数据支持。6.2 的C/C基因变异，C1896位(A83)的变异：前C/C基因变异，C1896位(A83)的变异是HBV中最常见的变异.野毒株】896位是G,变异为A,A83双基酸(TG。变异为终止密码(TAG),使前C蛋白的翻译终止，从而使eAg不能合成，此突变有助于HBV躲避开疫攻击但它并不影响报道复制，而形成慢性感染状态。这种状况临床上表现为HBeAg(一)、HBV-DN(+),而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎。即未经药物治疗的小三阳但HBV-DNA阳性者。上述变异也见于干扰索治疗后,因此提示以HBeAg转阴作为疾病好转的指标有时并不精确，结合HBV-DNA检测推断网。6.3 P基因区变异-10-P基因区编码HBVDNA聚合悔(DNAP),其自然突变率与逆转录病毒gag基因相近。第2798ntA-C可使DNAP中的个膈荻酸由苏氨酸取代，导致HBV复制缺陷CH前临床上广泛运用的胞仔类似物拉咪映咤(1amivudine)和乌昔类似物泛昔洛韦(famcic1.ovir)等抗HBV药物，作用网位主要是DNAP,通过与底物dNTP竞争结合以抑制HBV的逆转录和复制。但这些药物的运用产生了HBV的耐药突变株，而形成了“抗病毒治疗躲避"。HBV耐药株的突变就发生在DNAP基因内。DNAP催化中心核甘酸结合位区为一高度保守序列，即“酪级酰(丫)、武朝酰(M)、天冬刎酰(D)”基序(YMDDmOtif),是DNAP发挥催化活性所必需的关键结构。发生突变以后可能使已降低的病情加剧(即所谓反跳)，对所用药物产生耐受。YMDD耐药变异的防治：随着用药时间的延长，核甘类药物易引起病毒变异，导致耐药。为了削减耐药性的出现，可以联合用药。从理论上讲，干扰素和核甘类药物在不同的靶位点联合应用，可削减耐药株的出现。阿德福韦是个广谱的抗病毒药物。在H1.V治疗过程中未发觉有耐药变异。全部变异株对阿德福韦均敏感，且对联合变异也有效“二6.4 X基因区变异X基因是病毒复制的重要调整区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区变异影响到病毒的转录和复制。目前认为X基因区BCP、SP或PrCSP的变异变更了HBV基因表达的平衡，与HBV持续感染相关。这种变异株的HBsAg,HBcAg,HbeAg表达水平均卜降，但DNA水平与野生株相仿或稍高，提示病毒复制实力变更不大；将后一变异株与少代完整的X基因共转染细胞，则HBCAg产量比单纯变异株多3倍。但CabreriZO等报道HBVORF-X变异可能也是某些患者体内HBVDNA水平较低、病毒生物活性减弱的一个缘由。HBXAg也可能成为致敏CT1.攻击的靶抗原。患者血清中可溶性HBXAg相关多肽可调整CT1.对杷细胞的免疫识别，因此ORF-X变异可能亦不利于清除HBV。另一方面，HBxAg是一种强力反式激活因子，可通过多种途任促发肝细胞癌变”刈。7 .乙型肝炎探讨的细胞模型建立表达乙型肝炎病毒的体外培育细胞模型，对探讨HBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选与致癌机制的探讨有重要意义。7.1 肝源细胞系肝脏是HBV感染和复制的主要场所，故肝细胞是HBV感染模型的首选细胞“目前应用THBV培育的细胞系有成人肝细胞系、胚胎肝细胞系和肝癌细胞系，尤其是肝癌细胞系，11HcpG2,Huh6-C15,Huh-7,Hep3B,P1.C/PRE/5等，在HBVDNA与其基因组片段的转染细胞系的建立中占方重要的地位。(1)成人肝细胞模型:用含HBV感染颗粒的人血清接种培育的成人肝细胞，可在匕清中检测到HBV抗原和HBVDNA,表明HBV可感染原代培育的成人肝细胞，同时用PreS1.特异性抗血清能阻断病毒感染.川在含2%二甲亚矶(DMSO)培育液中加入聚乙二解可显著增加HBVDNA内吞量和提高病毒的吸附效率而不变更HBV感染的组织与种属特异性。HBV感染成人肝细胞模型与自然感染过程相像，病毒抗原可较长时间存在，细胞内出现HBVDNA复制型.但成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培育，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产生实力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也渐渐产降，限制其实际应用。-11-(2)胚胎肝细胞模型:人胎肝细胞系可较好模拟人体内肝细胞的生物学功能，并对血清HBV感染敏感，产生HBV复制型和各种病毒标记物，解放Dane颗粒。来H不同胎龄的胎肝细胞对HBV感染显示相同的感染动力学。但成熟的原代胎肝细胞体外长期培育特别困难，细胞分化实力有限，不能多次传代，旦胎肝细胞的分化状态对病毒复制可能产生影响，限制了其应用和探讨。(3) HePaRG细胞株:由于用血清干脆感染细胞更接近自然感染状态，适用于探讨在自然条件下病毒吸附、穿入宿主细胞的机制，与抗体的中和作用、抗病毒治疗等，而过去所建立的肝箱细胞株无法干脆用病人血清感染。Phi1.ippeGiiPon等1121从慢性丙型肝炎感染的肝癌病人体内分别，加入DMSo和类皮质激素培育，建立的HePaRG肝癌细胞株。HePaRG细胞株与正常的肝细胞相比具有相像的形态学和生理学功能，既可用于转染,又和原代肝细胞样适合于HBV血清干脆感染，从培育上消中可检测到HBV抗原和HBVDNA.而且该细胞株具布与正常人肝细胞相像的生物学特性，可以应用于探讨病毒感染的早期阶段包括仍旧未知的病毒分子受体、药物对病毒感染早期阶段的作用、抗病毒药物的筛选、药物的毒理学和药理学在内的很多领域。7.2 非肝源细胞系1980年以来，接连在肝外组织如胰腺、肾脏、骨的淋巴样母细胞和外周血单个核细胞等中发觉了HBvDNA与其基因产物，并且可作为HBV感染复发的用要来源，提示HBV除了肝细胞外，还有泛嗜性，这是将非肝源细胞列入转染靶细胞的重要依据。目前用于HBVDNA转染的非肝源性细胞系有:F1.5-1.,He1.a细胞、单个核细胞系U937细胞、树突状细胞等。这些细胞系可表达病毒的全部或部分抗原、HBVDNA,表明其内环境可支持HBV复制、包装和分泌CHBV基因在U937和树突状细胞中胜利表达对探讨HBV复制机理、在骨髓来源的细胞系中的调整、免疫系统对HBV的影响等特别有用。但非肝脏细胞装配和分泌的HBV颗粒，只是类似于H然状态的HBV病毒颗粒，与真正自然状态的HBv颗粒有很大差别。7.3 动物细胞系很多探讨表明，HBV可在动物细胞系中获得短暂或较长时间的表达。DCMeyCr创414探讨表明HBVS基因表达的小能白(SP)能与Ca，+依能性磷脂结合蛋白(humanannexinV)特异性结合，促进HBV进入大鼠原代肝细胞史制并进行表达，介导HBV跨种屈特异性感染。在动物细胞系中的胜利转染表明HBV感染的种属屏障在于其对靶细胞细胞膜的吸附与透过，而HBV的复制和表达则依籍于肝细胞内环境。此外，小鼠成纤维细胞系NIH3T3和1.tK、大鼠MOrriS肝癌细胞系Q7、果蝇细胞、非洲绿猴肾细胞VerO等，也常被选为转染靶细胞，可表达HBV的抗原和分泌病毒颗粒.HBV在非人类细胞内复制的细胞模型可作为在人类细胞内更制模型的补-151-52)充。7.4 展望HBV细胞模型是筛选抗HBV药物、探讨HBV生物学特点与其与细胞间相互作用的必要工具。己有的细胞模型在探讨HBV发病机理、免疫机制、抗病毒药物的筛选中发挥了确定的作用，但也存在问题：(1)无对病毒感染和致瘠机理合适的细胞模型；-12-(2)细胞表达的稳定性问题。今后建立的细胞模型应借助于分子生物学、分子细胞学的最新进展，找寺既适用于转染，又可用If1.I清干脆感染，接近肝细胞生理状态并能稳定表达HBV抗原的细胞模型，将对探讨HBV的生物学特性、感染姆制、抗病毒药物的筛选和致癌机制有重要帮助“参考文献1 .姚光弼等，临床肝脏病学，上海科学技术出版社2 .Young-Suk1.im1DongJinSuh.CurrentAntivira1.TherapyforChronicHepatitisB.JKoreanMedSci.2004;19:489-494.3 .病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001,19:5662.4 .谢天恩胡志红一般病毒学，科学出版社，20025 .Kozie1.MJ.Cytokinesinvira1.hepatitis.Semin1.iverDis,1999,19:157-169.6 .闻玉梅现代医学微生物学，上海：上海医科高校出版社，1999,105310677 .姚光弼，等.临床肝脏病学第版，上海:一卜海科学技术出版社.8 .中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会。病毒性肝炎防治方案C传染病信息，2000,13(4):141-1489 .王滨有病毒与健康，化学工业出版社，200410 .金奇医学分子病毒学，北京：科学出版社，2001.762785I1.任向荣R