醇型和酮型广藿香DNA甲基化的MSAP分析.docx

H的使用MSAP技术对2种化学型广常香Pogostcmoncab1.in的必因组DNA进行甲基化分析。方法使用甲基化敏感扩增多态性（Ineihy1.ationsensitiveamp1.ificationpo1.ymorphisin.MSAP）技术检测2种化学型、共计197个广笊香样本的DNA甲基化程度。结果4类MSAP位点信息的Shannon多态性指数的最高值或较高值均在阳春、德庆、高州大胴、禄步、广宁5个产地中产生:石牌广猿香（削型）与其余产地的广猿香（酹型）形成2个分支：广菰香居群间的变异所占百分比远大于居群内变异所占百分比，达60.66%：共筛选出IO条石牌产地与其余产地的差异性片段并进行测序分析，其中一条属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。结论可通过MSAP技术在不同来源的样品中鉴别出石牌产地的广箱香：广蜜香不同化学型的形成与其DNA甲基化水平有着密切的联系，尚需更进一步的研究。广求齐PogostcinoncabIin（BIanco）Bcnth.属唇形科刺浅草属草本或半灌木，具芳香化浊、发表解暑等功效,主治湿浊中阳、脱落呕吐等症目前根据主要化学成分含量的差异，可将广菰香分为2种化学型：广茄香酥型（广州、颦庆市裔要区产“牌香类”）和广笊香雨里（广东港江地区吴川、遂溪、雷州产“琼香类“）2。由于广指杏的核甘酸序列并未发生.变化，因此化学型的差异属于表观遗传变异的范畸。DNA的甲基化是种重要的表观遗传修饰，与基因表达、基因组防御、细胞分化,染色质失活和基因组印记的调节有关.近年研究发现，植物在发育和分化过程中通过改变甲基化的状态来调节基因的表达3,DNA甲基化水平在不同植物中都与其生长阶段存在着密切的联系4-5aMSAP技术是研究DNA甲基化的有效技术。核技术能够检测全基因组范围内5'-CCGG位点的甲基化模式，分析不同居群的中基化位点信息，还可针时特异性片段进行切胶测序，以明确与表观遗传变异相关的基因，适合于本研究中对于不同化学型广潴杏的分析。目前有关广循香的研尢包括百秋李静的代谢途径67）及使用分子生物学技术|8-9对不同种群的广布杳进行研究，但尚未发现有学者对不同化学型的广布香进行分子生物学研究MSAP技术被广泛应用下研究不同居群、不同品种植物的DNA甲基化模式及多态性等。1.i等”0的研究发现，MSAP标记技术可以有效地检测野生大麦种群内和种群之间的DNA甲基化模式：在OCana等11的研究中，23个程定的MSAP条带能够区分92.5%的前笥克隆个体：李宇等12使用MSAP技术分析不I对辣椒品种果实发育过程中的DNA甲基化时，发现辣椒DNA甲基化的位点既存在于DNA的编码区，也存在于非编码区。以上这些研究都说明MSAP技术是分析种群结构、探究物种之间变异的有效工具。本实验以不同化学型广蕾香为材料，使用MSAP技术对广/香基因组的甲展化情况进行研究，并利用得到的分子标记数据对不同化学型广莱香的遗传结构、遗传分化程度、遗传距离和遗传多样性等内容进行分析探讨，初步探索不同化学型广流香的分子生物学上的区别。I材料与仪器1.1 材料样品为采自10个不同居群的广指香种质，共计197份，经东药科大学教授鉴定为广汇:香PcgostenioncabIin（B1.anco）Benih.,样品信息来源如表1所示。从每侏广就香上采集20片生长良好、无病虫害的叶片，硅胶干燥并放入-20C冰箱中保存备用。i3FmrrrttIM1Samp1.eM35tofFCaMnfrom<ffOrgQI必号年厦经厦««BS1.-X南门”2以，江友均队19JTN2016-11SX1-204USHit!UMM2I21Nnoor三加“12GZMS广东茂名市昌州6,JHHIIOWE刈M1.YC1.N弟江市用6痔京氏乡U22034IusrB201611DQb23tIJT1.UR里“8212TN11123三刈0111.1120广豪佚a11X曜午“H22WN1114E刈&】11.SIN金庆届K抬aI.分M2229SH24S*t加Ig1.CN1.RWITM<f三Hit1.H233C11?TrEXHG1.1.SHIY厂拳伍K会M埼口KNIH23504IIJTtT指心I1.SPI1.SWHmJ-HKUtItK2J21N113JrE2017-011.2 试剂3种限制性内切拗Hpa1.KIoU训.）、MSP1.（20U1.）ECORK20U1.）TaqDNA聚合旅（5U1.）.ATP（0.01.mo1.1.）,NEBbuffcr4均购自NEB（）有限公司：BSA（20mg,i1.）购自生物技术有限公司；植物DNA提取试剂盒、MarkCr购自公司：胸切产物纯化试剂盒购自Q1.AGEN公司：普通用物、接头序列由基因公司合成;带荧光修饰的引物由公司合成、DTT试剂、PCRIUbes、1.5m1.离心管购自Axygcn有限公司1.3 仪滞D1.-600C型电泳仪（生物科技有限公司）：BG-SubM1.D1.型水平电泳槽（生物技术有限公司）:RCan-4100型全自动凝胶成像系统（生物科技有限公司）；K55OOP1.us型超微量分光光度计（科技发展有限公司）；3KI5型台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司）：MJ-54A型液压蒸汽灭菌锅（美国施都凯仪器设备有限公司）：373OX1.型毛细管电泳分析仪（AppIiedBiosystems公司）。2方法2.1 毛细管凝胶电泳使用庄盟植物DNA提取试剂盒提取DNA,通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和超微星紫外分光光度计检测所提取DNA的痂量、浓度与纯度。提取之后，稀释至20ng1.,-20'C保存.根据Gucvara等"3J的方法进行朝切、连接和PCR扩增。将选择性扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测，可得到经2组的切、扩增后，包含广指乔样品的基因组DNA的MSAP位点信息的氐！文件以及荧光检测图。经同组酶切、选择性扩增后，石牌产地含有而其他产地不含有的MSAP片段作为差异片段进行测序分析。其中，使用的接头及引物的序列如表2所示.«2广雷香MSAP分析引物筛选使用的引物和接头序列Tab1.e2SequenceofPrimerSandadaptorsusedinse1.ectionofMSAPana1.ysisPrimerSofP.cab1.inEc,oRI-adapt01（接头）EcoRI-adap½r2（接头）mHAp1.-adatcr11接头）您血峋必如红2建头）EM+（8Un1.引物）fh>RIAAFAW（选择性犷增引物）立成IAGHEXU（之择性扩*弓物）&oRbAGROX1"（法界性扩增引物）马闻岬+CAA"（房界性扩增引物）班IIMP1.CAT'（充挣性扩增引物）您血MP1.CTA,（选绛性犷增引物）班加MSP1.eTr（无界性扩增弓构）5CTCG1.AGACTGCGICC-3,5'-AATTGGIACGCAGTC35GACGAGAGTCTCGAT3,5-CGATCGAGACC.AT-3,5GACTGCGTACCAATTCA3'5-GATGAGTCTCG.4ICGGC-3-5«AcTGCGTACCAATTCAAS5-GACTGCGIACC.A11CAG-3-5GACTGCGTACCM11CAC3'5-GATGAGTCTCG.AICGGCA.V3'5-GATGAGTCGACGGCAT-3'Sgatgagtctcgaicggctaj5FATGAGTCCGACGCC113上标的相同数字表示选择性扩增反应中一对引物组合Thesamenumbermthesersc11ptindicatesapairofPrimCTcombinationsmtheSeIeCt1.Veamphficaonreacncn2.2 数据处理2.2.1 不同产地广藁香MSAP位点信息参考自Schu1.z等”4及MixScoring2软件获取MSAP位点信息.2.2.2 UPGMA聚类分析及PCoA主坐标分析使用NTSYS-2.IOc软件对MSAP位点信息数据进行UPGMA聚类分析及PCoA主坐标分析，可得到197个广前香个体的树状聚类图及PCoA分析图。2.2.3 AMOVA分子方差学分析使用Ar1.eqUin-Ver3.5软件对MSAP位点信息数据进行AMOVA分析,通过MSAP位点信息计算与广祇香基因组DNA甲基化有关的广箱行物种遗传变异的来源以及各个MSAP位点的统计学意义。2.2.4 差异片段的回收测序分析根据UPGMA等分析的结果，筛选出经同组的切后，将测序分析所得到的MSAP序列信息与本课题组的广/香转录组序列进行本地BIaSI比对，以找出差异片段可能存在的基因中，哪些与广液香醉或丽的代谢通路相关。在数据计算中，多态性位点比例和Shannon多态性指数计算公式如下：多态性位点比例=多态性位点数/该类型MSAP位点总数Shannon多态性指数=2PiIOg2pi其中pi指MSAP标记中评分为“I”的标记占该种群内所有标记的百分比。3结果与分析3.1 样品DNA的检测结果系因组DNA需满足2个条件，方可进行后续实验.第一，基因组DNA经超微量紫外分光光度计检测A260/A280比值在1.71.9;第二，经1%琼脂糖涨胶电泳检测结果为仅出现条明亮的条带，无拖尾等基因组降解现象，如图1所示。不满足任意一个条件的DNA样本需重新提取检测.MAtate1.-fWWSiniAM1.>i07JmnEKAOcagnugn图1YC1.-20*ITR*KtaDXAMMSF«1G*M«kD5A4hmimmpofYC1-2OWP.ctMi3.2 毛细管凝胶电泳分析结果毛细管电冰结果如图2所示。每个样品经2组机切、6对选扩引物扩增后，共有12张荧光PCR检测图，本实验挑选2对引物的荧光枪测图作为代表说明。荧光PCR检测图中的横轴表示各个MSAP位点的bp值,纵轴表示该位点序列的DNA浓度，如图2-B中205bp处存在峰高为约1500OrfU的位点.AGRIAATAM电二5C11HI40«22JTtaIItT1.r地引物的WIa智电/图Fg.?Capdbnd<cfpbo*ot“twopansofsekcthWBf1.hficOO1.1.pttswr3.3 数据与分析3.3.1 不同产地r嘴香基因DNA的MSAP位点信息在本实验中,使用了6对选择性扩增引物时10个产地共计197个广稚香样品进行MSAP分析，一共得到2427个MSAP位点,其中类型I占33.83%,类型II占33.25%,类型III占3292%（类型划分标准见表3）。其中的1053个多态性位点内一共检测到了78297条MSAP条带，每对引物组介检测到的多态性位点数量范用是1372IO,大多数原始数据矩阵中的多态性位点经过MiXSeOring2评分方法转换后都有多种类型的MSAP条带，少数仅占一种类型。在最终得到的多态性位点中，821个包含未甲基化的DNA片段,807个DNA片段含有甲基化类型为HMECG.或MECG-（id为“M”型）的位点，799个DNA片段含有甲基化类型为HMECCG（记为“H”型）的位点。表3口nS和"$p1.酶对5(CGG位点不同甲基化类型的敏感度Tab1.e3SenSiriVityofHpa11andMspIenzymestodifferentme(hy1.anoutypesat5,-CCGGsites甲基化状态HPanMSP1.类型非甲基化+÷I内部胞嗑除全甲基化÷11内部胞嗑哩半甲基化÷11外部胞嗑啜半甲基化+一m外部胞喳哧全甲基化一一IV两个胞喳唉的全甲基化IV两个胞嗡唳的半甲基化IV"表示能缪萌切-一-表示不能H切""meansthatitcanbedigested."-"meanst1.atitCanDOtbedigested不同产地广茄香的MSAP总体位点信息见表4,“H”型/“M”型/非甲基化甲基化位点信息见表5。其中，多态性位点指至少包含2种类型，且含样品地少（样品数目22）的位点，独有位点数指某产地至少有一个样品含有，而其他产地的样品不含有的位点。««7RKCHV¼FSWQAfBCTjAUIIaftvaMMm<MSAPet*MXofDfr<ndf9tspBF0MSAPt，各f1.RxMtR%nShMm川教毒南门BS1.X62$MS20031120125X1XMT»715»308AMXWGZI-IS0%WiMW¼021RYC1-20TSS6512SM203O1.t«DQ1.tnTMJ2M«7017«*1.11M3»K796JOS1.B1.»W775HM57022CTGN1-20MJ850%61122021四食SHI2iW<51ISMn08SM-ISM1.3%161。Ou从表4、5中可以看出,多态性位点数、多态性位点比例、Shannon多态性指数这3个指数的最高值或较高值均在阳春、德庆、高州大洞、禄步、广宁这5个产地中，而四公、遂溪,莲塘这3个产地的Shannon多态性指数均为最低值，猜测可能农户之间的频繁弓I种导致5个产地中的广蒲香种源混乱，而后3个产地则与之相反。«不M产广-H"fi-W8化位与<8罪I*S"!np*M,'npe«««BK51.MHrtra11ana<<ttfTr<EOnX1.»5raM*户嫉-H'ft'M祖甲化公总皎$左归Htt'mfitta5«-H'V-Me总重甲“化G公比Mtt-M-ttMat*afc<ia-M*-M-GJ|74?|.3«0MMn/14)>Mits)1364«BOBO12HM15X17«isir.wWOiWTt1.1.WX”O(WOOSOW次“031*35*Mai1.¾1500021.OXmDMMM4XIa处第OIaQ工014&空皿湖2rnnu“9737用NN3S4,I1OISOXO17国1“IgiI6IMIg“6XMooo7o2SK221MI2S3<22*2M33X»043731INN9025。16024r2112W652T7aW5MMJ4H3I71H>2V9nI雄1914115C1818Jiwnwnn»218。1。0弊0IO广州石!"TV1.tt1.*2115474e7.013014006石牌产地的样品，虽然其样品数目较少，但其独有总位点数、独有“II”型甲基化位点数却处于较高水平，独有“M”型甲基化位点数更是为所有产地样品中最高，此外，其非甲基化位点为所有产地中相对较低。石牌产地样品测得Shannon多态性指数在不同的类型中均处于较低水平，这说明其种源单的可能性较大。3.3.2 UPGMA聚类分析所有产地广液香样品UPGMA聚类图如图3所示，其中分支I为海南白沙产地所有样品聚成；分支2为遂溪、高州大洞、德庆、莲塘、禄步、广宁、四会7个产地的样品聚成：分支3为阳春产地所仃样品聚成：分支4为石牌产地所有样品聚成.从整体上看，石牌产地的样品形成独立分支，与其余9个产地的样品形成第I分支：在其余产地的样品构成的分支中，阳春产地的样品形成独立分支，与剩余8个产地的样品形成第2分支；在剩余8个产地的样品形成的分支中，GN13（肇庆广宁13）样品与其余样品形成第3分支：第4分支则由白沙产地样品聚成的单支与其余产地样品共同聚成的一支组成.从结果上看，本实验用于MSAP分析10个产地样品中，仅海南白沙、阳春与广州石牌3个产地形成独立分支，而其余7个产地的样品中，不同产地的样品互相交叉，居群之间较为混乱（图4）,从地理位区上看，同样来源于广东省产区的9个产地样品并没有与海南白沙产地的样品构成两大分支，同样来源于广东省与庆市的德庆、禄步、广宁、莲塘4个产地的样品同样没仃坡成支,说明通过MSAP分析得到的不同广指香居群聚类信息与地理位置无明显的相关性：从传统药材市场上的分类来看，属于“石牌浓香”的广州石牌样品与其余样品可以区分开，这与传统意义上以“石牌藏香”作为道地药材的观念相符：从样品来源与栽培方法上看，广州石牌产地的样品保留了单的种质，没有从其他产地引种,并由老农户以其独特的栽培方法种植，而其余产地的样品引种频繁，样品来源混乱，种植技术较为粗糙，这是造成其居群内种质混乱的原因之一；从本课题组对于不同产地样品的化学成分测定结果上看|15卜归类于“朗型”的石牌广筮香与其余产地广布香分成了两大分支,但归类于“弱型”的莲塘产地广布香并没石与石牌产地广裁香聚成一支，这表明，DNA甲基化仅仅是广猿香出现不同化学型的原因之一。U-Uutn<SH-Sdu1.B*5SX-Smcdffi由理冷If内足/的7个广段If舲分行给收类网114OaMrt（U“IIBMpaf>a1.MmP1.rWAcMmPoPUb6ou，QbMappearcIuockwitkinPOPt1.bfion3.3.3 PCoA分析不同产地的PCoA分析如图5所示,其显示的结果与UPGMA聚类结果类似.在时产生分类具有47%影响因素的Dim-I轴上，石牌产地的样品与其余产地的样品可以明显区分开：而在对产生分类具有29%影响因素的Dim2轴上，先是将阳春产地的样品区分成一个居群，然后是白沙产地的样品形成一个居群，其中虽然BS17样品（海南白沙17）与大部分样品形成的居群仃定距离，但仍可将其余样品视作一个居群：最后是剩余产地的样品所形成的居群,可以看出居群之间非常混乱，已无法区分开。PCoA分析的结果同样揭示了不同产地广徜杏样品通过MSAP分析得出其基因组DNA甲基化情况的显著区别。图5不同产地广蜜香的PCoA分析Fig.5PCoAana1.ysisofP.cab1.infromdifferentp1.aces3.3.4 AMOVA分子方差学分析居群的AMOVA分子方差学分析结果如表6所示。可以看出居群间的变异所占百分比远大于居群内变异所占百分比，此结论与PCoA以及UPGMA分析结果致。此外,对MiXsCOring2评分方法转换得到的所有位点进行位点之间的AMOVA分析(IocusbyIocus),结果发现，2427个位点中，58.90%的位点具有显著性差异(P<005%),共计1429个。表6不同产地广嚣香样品'ISAP位点信息的.UIOA分子方差学分析结果Tab1.e6Resu1.tsofAMOAofMSAPsiremfomariouofP.cab1.insamp1.esfromdifferentongins变异来源自由度平方和变异组分Too居群间921917.465120.3992160.66居群内18614521.08178.0703339.34所有位点的F统计固定指数平均值为0.61TheaverageVaiueofFstatistica1.fixedindexfora1.1.sitesis0.613.3.5差异片段的网收测序分析根据以上分析的结果，可以发现石牌产地的样品与其他产地的样品存在较大差异。为寻找可能含有差异片段DNA序列的功能基因，将石牌产地2组解切-选扩后的条带分别与其他产地的进行对比，并筛选出仅石牌产地含有，其他产地不含有的选扩条带，-共10条。将这些条带测序后，以本课题组测序所得广蜜香转录组序列为数据库，进行本地B1.ast比对，比对结果如表7所示。其中由引物组合EcoRI+AG-HEXHpa1.I!sp1.+CTA选扩得到的序列长为252bp的条带，该序列与c387882.gmph_c()序列成功也配，其评分为127,E值为3X10-29,表明该条带与该段序列同源性较好，该段序列属F丝城酸/苏氨酸蛋白激的家族，这些激旅参与蛋白质的磷酸化作用，其璘酸化过程已被证实参与到光、高盐、激素、干不等信号传导途径中，此外，丝氨酸/苏氨酸蛋白激能基因在植物抗病途径中也发挥垂要作用16,后续研究中将挑选更多的差异性片段进行测序与比对，以期筛选出与广流香耨/胡代谢通路中的关键基因或关键的。苍IenM"H*WXHa件J8*1.itiU*SMsu1.o(diffmtMwsUfwmuSM1.MAaiBZ<Mbm0b序列门说分有60<m3门序外M0.*q125x(mMM*M1凶3趣的*.c605x1.小M储c258B6CT.cO4SXIOTcW91Wgnp.c2M0079A1.t金尔”门体菱事M0079-AC成cM89mg11(A.c1.M0079小SMA“J8WOpifA-B36OOWWS1.wI.9MOJ1.SNWSK1.-e<i<tW1.ftC冽4iir11eM031nm114讨论本研究以广布香叶片作为材料，使用MSAP技术分别研究10个不同产地广蕾香博因组DNA的甲基化情况，并使用UPGMA、AMOVA,PCOA等方法对数据进行处理，对比前人对于广於香的居群分析研究，本研究有以卜创新之处：（1）分析的样本员做大。包括10个不同产地的197个样本，能够较全面地反映广流香居群信息：（2）笫一次使用f在5'端添加荧光修饰的ECCRI-选择性扩增引物,并使用毛细管电泳法代替了以往使用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析广莱香居群，在增加了能检测到的扩增条带的同时，避免了使用数码相机结合人工识别条带的误差。（3）本研究第次对石牌产地的样品与其他产地的样品经选择性扩增后存在的差异条带进行了回收测序分析，为后续对手广希香表观遗传的深入研究奠定了基础。在对不同产地的MSAP位点信息的检测及对比中，本研究得到10个不同产地的MSAP总体位点信息、“H”型甲基化位点信息、“M”型甲基化位点信息和非甲基化位点信息.其中，四类信息中ShannCn多态性指数的最高值或较高值均在阳春、德庆、高州大崩、禄步、广宁5个产地中产生，表明这5个产地之间出现频繁引种，种源不清的可能性较大。在对不同产地的UPGMA聚类分析中，从图3可以明显看出石牌广恭香（酮型）与其余产地的广荒香（醇型）形成两个分支,且在对不同产地的PeoA分析结果（图5）中，石牌产地的样品也能与其余产地的样品明显区分，这与不同化学型广色香在其性状及化学成分含量出现较大差异的结果吻合。此外，高达60.66%的居群间变异来源占比（表6）也说明了此结论。罗集鹏等在对6个产地广茄香挥发油主要成分的研究中，将广州、聚庆地区高要产广布香“酮型广笊香二而吴川、遂溪、雷州及海南产广菊香归类为丽里广循杏。本课题组15在根据不同产地广循香挥发油的主要成分进行聚类时，得到了相似的结论：龙洞、莲塘、石牌3个“酮型”广凌香聚成支，海南白沙产广楚香聚成一支：其余产地的广茄香聚成一支.但在研窕结果中,属“AN型”广莱香的莲城产地样品却没有与石牌产地的样品聚成一支，而是与遂溪、高州大相、德庆、禄步、广宁、四会6个产地的样品构成了一支，其原因可能如卜丁（1）DNA甲基化是表观遗传变异发生的重要过程，但除此之外，非编码RNA以及染色质中同样可产生可遗传的表观变异，植物表观变异来源的多样性是导致本结论与化学型聚类出现差异的歪要原因；（2）MSAP仅能检测5-CCGG位点存在的胞啼呢甲基化，因此MSAP技术分析的结果不能完全代表广布香基因组中DNA甲基化的类型及比例：（3）广添香主耍化学成分的代谢过程受多种的及功能基因的影响，由丁基因变异存在不确定性，若产生变异的基因不参与广笊香的主要化学的代谢过程，则很雄对广循香化学型分类产生影响。为了寻找可能导致石牌产地与其他产地广猿香出现遗传变异的功能基因，在时差异片段的测序分析中，本研究发现，变异的形成可能与c387882.graphO序列密切相关，该段序列属于丝狐酸/苏翅酸蛋白激的家族，在蛋白质的磷酸化及植物抗病途径中发挥重要作用。在后续的研究中，可以进一步挖掘差异片段所属基因的转录或其下游基因的功能等，以期进步完善导致不同化学型广色香形成的基因表达过程.附参考资料：广指香化学型分型及形成时期研窕广希齐PogoStCmonCabIin（B1.anCO）BCnth.为唇形科植物，干燥地上部分入药，为著名的“十大南药''之Hb也是布香正气液、连花清痕胶囊等中成药的重要原料，功效芳香化湿、健运聊目、辟秽解毒2-3。广/香主要分为爵型和附型2种化学型，以百秋季醉、广液香雨的含量比值为划分依据4,质优效佳的道地药材石牌广蓿谷与品质相近的高要广慈杏的广掂香丽含量远高于百秋李静，为酮型广蕾香，在胃肠道疾病等方面药用效果较好：海南、湛江、阳春等产地的广蓄香大多用F提取挥发油，百秋季醉含量远高于广董香朋.为静型广整香，具有抗病毒、抗炎、抗幽门螺旋杆菌作用5-7。由于种质退化、产量及经济效益降低，道地药材牌香及质量相近的高要广歪乔濒临灭绝，市面上大多为海南、阳春、湛江等产区药材。为了研究2种化学型广布香组培苗生长过程中白秋李醇和广布杳朋的动态变化规律,探究广循香化学型的成因，本实验采用组培快繁技术，以海南、尚要广荒香为研究对象，分别培养获得不同生长时期的静型和酮型广莱香组培苗，采用GC-MS法评价不同生长时期2种化学型广燕香组培苗中化学成分差异。1材料1.1 药材广菊香叶片（产地），经药科大学中药学院教授鉴定为唇形科植物广慈香POgoStemonCab1.in（B1.anCo）Benth.的叶片。1.2 仪器GcMSQP-2020（日本岛津公司）：RE-52A旋转蒸发仪（生化仪胧厂）：KQ-250E数控超声波清洗机（超声仪器有限公司）：SaroriusBP21ID电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）：电子分析天平万分之一，奥豪斯仪器（）有限公司:HH-6恒温水浴弼（科仪涔厂）。1.3 试剂百秋李醇（批号，纯度98%）、广/香州（批号，纯度98%）对照品均购白生物科技有限公司：十八烷（批号，纯度98%）对照品购自生化科技股份有限公司：技术琼脂粉（批号）购自微生物生物科技有限公司。正己烷（色谱纯）、二氯甲烷（分析纯）均购自化学试剂有限公司。1.4 培养基丛生芽培养基，配方为MS+0.2mg，1.6.BA+0.1n】g/1.NAA：生根培养基配方为12MS,PH值均为5.86.012方法与结果2.1 植物组织培养将静里、酮型广揩香叶片用自来水冲洗1.2min,75%酒精漂洗5s,无菌水漂洗2次，0.1%升汞溶液消毒灭菌8min,无菌水漂洗5次。叶片剪成5nm×5mm叶块，接种到丛生芽培养基，从萌芽开始计算生长时间，在40d时选取生长健壮、长势一致(高1.2cm)的不定芽，接种至12MS培养基中继续进行生根培养，设定条件为培养温度(25±I)'C,光照强度20001.x,光照时间14hA1.每隔30d分别取出30瓶组培苗，净制，晾干，在4C下保存备用。生根培养20d后(瓶内苗生长6()d时)，取出醉型、AH型生根组培苗各2(X)瓶,水培I冏后移植至相同的上壤中，浇以0.5%灭菌灵、0.2%生根粉混合溶液，每隔30d收取20棵组培苗，净制，晾干，在4C卜保存备用。2.2 百秋李静、广港香甜含室测定2.2.1 供试品溶液制备取粗粉约0.5g至锥形瓶中，加入二氯甲烷30m1.,超声处理3次，每次20min,浦过，合并浦液，回收溶剂，残渣加正己烷溶解，转移至5m1.量瓶中，正己烷溶解，045m微孔灌膜过滤，即得。2.2.2 对照品、内标溶液制备精密称取百秋李醉、广香飘对照品适量，正己烷定容至1.mgm1.,即得对照品溶液.精密称取正十八烷对照品0.5mg,正己烷定容至Im1.,即得内标溶液。2.2.3 分析条件GcMS色谱图见图I。2.2.3.1 色谱DB-5MS毛细管柱(3OmXO.25mm.0.25m):程序升温(初始I2O,C,保持2min,2cmm升至160C,保持2min,IOCmin升至180。保持2min,30Cmin升至280*C):分流比30：I；载气高纯氯气;柱箱温度120C；进样口温度25O1C:接口温度25OC：进样量1.1.2.232质谱EI离子源，温度200匕电离能员70eV；扫描痂量范用nz50-500(百秋李醉m138,广菰香秋m168,十八烷WZ57)：溶剂延迟2min.3.0×IO4-5.O×IO,-注：A为对照品,B为瓶内生长210d醇型组培苗,C为移栽自然环境生长24Od静型组培苗，D为瓶内生长3(Xk1.酮型组焙苗，E为移栽白然环境生长24Od酮型组培苗。I.百秋季静2.广笊香酮3.十A烷1.patchouIia1.coho1.2.pogostonc3.octadecanc图1各成分GC-MS色谱图Fig.1.Gc-Mschroniatogramofvariousconstituents2.2.4线性关系考察精密吸取“221”项下对照品溶液适量，制成系列历量浓度，在“222”项条件下测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面枳为纵坐标(Y)进行回归，得方程分别为百秋季醇Y=30465X0002(R2R9992),在00001().0ImgZni1.范用内线性关系良好：广蕾香胡Y=593.25X-1.6591(R2=0.9996),在O.(X)10.4mgm1.范围内线性关系良好。2232IO203015min2.O×IO41.0*IOe-02.5×IO62.2.5 精密度试验精密吸取“221”项下对照品溶液适欣，在“222”项条件下进样测定6次,测得百秋李醇、广循香雨峰面积RSD分别为0.28%、0.91%,表明仪器精密度良好。2.2.6 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24h在“222”项条件下进样测定，测得百秋季醉、广指香酮蜂面枳RSD分别为1.21%,2.12%,表明溶液在24h内稳定性良好。2.2.7 重笈性试购取同批样品6份，在“221”项下方法制备供试品溶液，在“222”项条件下进样测定,测得百秋季醉、广器香朗峰面积RSD分别为4.82%、2.70%,表明该方法或更性良好。2.2.8 加样回收率忒验精密称取同一批各成分含量已知的样品约0.25g,共6份，精密加入对照品溶液,按“221”项下方法制备供试品溶液,在“222”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表1“yq«o¼DHMOM0HBrgMrtt>MB*MrM11wt*M*1IOia9.MJ9B01.WMW0WM»I1.IWJBmw)MO.6E9amRMa»Ir111yVIMIM41e。5表I各成分加样回收率忒验结果(n=6)Tab.IResu1.tsofrecoverytestsfrvariousconstituents(n=6)2.3样品含量测定结果见表2.MM1K*AKHIrtta*,Mt0tMKAAHIrm七,-5,1'一I'MX£<vrai)w<*>-JH.,)«i'a!»IM4MM».amM2a01nt.G&IM.122<.«n*HM.1S*61»。I1.w>IW44Maan1SM(»2e19I9I1.MC1.a«>I111.3«»IM1.twOTV*:I*IFQ<r>1.,一IBW0)VM】U>Mm4VNa>nnt*C1.I«WXW*4IW3anInfMWBZ99an.4«1.n，BM1.>M»61BITQH4II*1»1,5表2各成分含量测定结果(n=3)Tab.2Resu1.tsofcontentdeteminationofvariousconstituents(n=3)2.2.9 广精香组培苗指标成分动态变化随着生长时间延长，醉型广/香焙养瓶内生长组培苗中百秋李醇含设在OOI9O1.51.mgg范用内先降后升，而广笊香酮含量升高：在3O21()d,广指香酮含量均高于百秋李静，见图2A,随着生长时间延长，移栽自然环境生长的醇型广色香组培苗中百秋李醇含量呈递增趋势，但在24Od时仍低丁外植体植株：广/香雨含量在15Od时最高，但总体呈下降趋势，在24Od时与外植体植株相比无显著差弁；在3O-2IOd,广蕉香酮含量均高于百秋季醇：外界生长21Od时，百秋季醇含量高于广指杏酮，表现出醇型化学型特征，见图2B。2.2.10 菰香组培苗指标成分动态变化随着生长时间延长，泡型广猿香瓶内生长组培苗中百秋李醉含欹在OOI3-OO22mgg范国内波动，变化不大，而广潴香耐含量逐渐增加，在2