DB51_T 3184-2024 医用供体猪 基因鉴定通则.docx

ICS07.080CCSA40U!川省地方标准DB51/T31842024医用供体猪基因鉴定通则20240719发布2021608蛾四川省市场监督管理局发布DB51本文件按照GB,，T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则8的规定起草.谙注做本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不汽也识制专利的贵住。本文件由四川省经济和信息化厅提出、白口并解择.木文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、成都中科奥格生物科技有限公司、四川省医学科学院四川省人民医院、四川泰康医院、南京医科大学附叔苏州医院、海南医学院第二酊制医院、华中科技大学同济医学院附划同济医院、空军军医大学第一附属医院、成部达硬实枝动物自限公司、成都爱莉眼科医院、四川行机械研究设计院（集团）育限公司、四川省实股动物学会医用旅专业委员会。本文件主要起荒人：冏李华、潘登科、马明侠、邢向阳、陈璐'邓绍平、王佳梅、李艇远、张玉兰、王毅、杜嘉祥、陈凰、蒋子敬、炎科峰、杨恒铉、钟浩、姚晓明、庄项、其为。医用供体猪基因鳖定通则1本文件规定了医用供体猪翦因签定的总体原则及鉴定方法.本文件适用于医用供体猪的生产、引种、交付过程中基因界定。基因修饰动物的基因盥定可参考本文件.2 范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中.注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改总）适用于本文件.GB/T30989高通地基因测序技术规程GB/T33681.1高通量基因测序样本预处理方法第1部分：动物组织样本Bi处理GB"35537裔通埴域因测序结果评价要求GB/T38177基因表达的测定蛋白印迹法3 *WW½下列术喷和定义适用于本文件.3.1EEff1.供体Itedica1.donorpigs通过生物工程技术获得，用于提供医疗用途的活器官或生物材料制备的低免疫原性猪及其群体，3.2SSWWgeneticmodification利用生物化学方法惬改生物遗传物质，使生物产生新性状，修饰Zf式主要包括转基因、暴因编辑介导的嬖因定点插入和茶因破除3种，注；灰川供体指常见刘闲修饰名称及种类见附录A,33苓因蔓合geneintegration将特定痕因片段导入宿主加因组内的法因修饰方法，包括转基因和%因定点插入，3.4基因KNtgeneknockout将特定基因片段从基因组中去除的基因修饰方式。3.5迨传11定性geneticstabi1.ity通过连续检测不同代数基因修饰动物基因型、基因表达情况来评估基因修饰在动物群体中遗传稳定及表达稳定的手段.3.6XE9if1.ftW3E*genoMstructura1.variants1）B51,31842024在医用供体猪获得过程中，基因组上发生长片段（>50bp）的序列变化和位置关系变化.雷西那f1.结构变异包括出T段序期（fi入或删除.中联羽红、染色体倒以染色体内部或臭色体之间的序列别立'基因娉贝数变井以及嵌合性变介等.3.7yRJOfHarget与招标不同的荔因也位置和/或核酸序列.示例：站合脱靶、崛帆祀、州眠祀、序列改变脱把，注I编辑脱史风于非预MI倒1匕（*;ISO5O58z1.-2O21,3.1.,413.8高JU1.N序himthr<×u邮Utsequencing以次并行几十万到几百万条核酸分子序列测定和般波长较短等为标志，适用于IWA的测序技术.来海GBT35890-2018.3.114总体朦JN葩因签定是医用供体猪制备过程中正要祖成环节，医用供体猪制备、价选、交付等过程应对其进行基因整定,因此用途的特侏性，医用供体猪葩因签定应同时考虑安全性和有效性，降低因基因修饰技术引入的不可控因素.安全性和有效性评价应结合设计预期、荔因修饰类型迸行烷合评估，密定项目可参考表1.«1服用供体案苔因整定评价事目序号系定/检测项目评价类型1基因型有效性评价2亚因表达3迪传造定性遗传稳定检测4必因组钻构变异安全性评价5脱把5聂定9（目及方宏5.1 WtttWMft1 .1.1*89BA5 .1.1.1蔓龙方法样本DNA提取可选用符合要求的中件试剂盒进行提收,也可由实验室自配试剂进行提取,引物设计应在目标茎因（拟整合基因/融除基因迎位）上卜游设计引物.样本DNA提取后，符合质域要求的DNA进行PCR扩增,产物经琼脂械凝胶电泳，观察H标条带判定是否符合预期,和定些因整合见5.1.1.2a）.判定目标基因的是否敲除，应将符合预期的条带网收，进行测序（见5.1.1.2b）.&弭为整合鉴定小例1.WI隶B,植因»除卷定，J制见府就。5.1.1.2结果判定a）出现H标条带，则判定携因整介仃效，b）目标片段测序结果和参考序列比对,比位产生不为3的倍数碱基的插入和缺失，则判定基囚被除存效.5.1.2暮因我达5.1.2.1检焉方法选取与目标蛋白相结合的特异抗体对医用供体猪如织、细胞水平进行蛋白检测。可采用蛋白免授印透法、免疫殂化/免疫荧光、物联免疫吸附技术、流式细胞术等方法进行检测。建议根据不同生产工艺选和合适的检测方法，蛋白免疫印透法可作为基础方法选用，蛋白免疫卬进法检测及判定方法可公考GB.T38477.蛋臼免疫印透、免疫祖化（荧光）、油联免疫吸附技术检测示例见附录B流式细胞术技术检测示例见附录C.5.1.22M自免疫印逸法Iaw定a）成僮图片木底干净，能观察到转卬腰均匀的轻微背景轮廓，H标条带清睢旦不过喋，即可判定目标蛋白友达.b）基内整合类应有目标基因蛋白表达，俄除类险无目标基囚蛋白友达.5.25.2.1 爱用要求医用供体猪自然繁什进行拉大化培养时应符合对闭抑或近交系的育种方式,同时应检测基因遗传稳定性.5.2.2 栩M方法医用供体猪群体先代个体均应进行翦因型鉴定和基因表达检测，方法见51.应连控监测3代以上,5.2.3 结果分析医用供体诉期因型骁定及期因表达检测结果符合基因分掰定律和自由组合定律，则认为具有遗传栈定性.5.3 安全性讦价5.3.1 物色体飨种变鼻和BUBtM在基因修饰过程中.存在臾色体结陶变异和基因修饰脱比的风险,应对除代个体进行染色体结构变界和脱祀检测，评价安全性.聚集医用供体猪筋因修饰前后的血液或出织进行高通玳测序，获取医用供体猪制因组序列信息，进行生物信息学分析,祥木处理参照GB,T33681.1的要求执行，测序方法照GBjT30989进行，测序侦*控制参照GBJT35537执行.5.3.2 第果分析5.3.2.1 染色体It构变鼻茹因梅饰前后,除西因修饰位点外,染色体其他区域西因序列无差异，医用供体指基因组未发生甘预期基因片段插入、序列我失、但置、弁位，则认为在医用供体猪制备过程中未引入基因安全风险.5.3.2.2使用CaAOFFin&kCR【SPRRGENToo1.s(rgenome.iwU)或类似律法模型工具，在猪粒因俎春考序列内也纪脱无风险位点，允许SgRNA的比标序列存在1个4个错配，灰用供体垢脱靶各风险位点序列信息和基因狙参考序列致，则认为没有脱靶,反之则存在脱靶风险.M«A(*Mtt)医用供体宿Itjut因名及修的突St医用供体诣常见西因名及惟饰类型见表A.1.«A.1医用供体着It期(因名及修It类S1.然因敲除GGTA1.I(JAI.VT2B1GI2I.CMA1.IPERVS1.Ac1.assIorR2M基因整合hxvnnnifihmnrc<fact<>rpmt<intr«nxgmic(hCI>1.6-1.R)humnderny-ncccIcrntingfn<:tortrnnxgmic(hCI)65-tg)huatinmettbmeIiihibtorofFeaC1.iVd1.ysistransgenic<hCD6-tg>hu11nc<M1.etent-reuIatoryProIeinC1.inhibitortransgenic(InC1.-INH-Ig)H1.A-EZIiUtMUibeta2-(iicro>：1.obu1.intransenic<1.1.-E.zB2-1g>hu11B11sitcna1.regu1.atoryproteina1.phatransgenic(hCD47-tg)humn1.EA29Yt11mx1gcnic(1.J1.A2!,-tg)humnC1.A1-Igtransgenic(IiCT1.M-1.-tg>porcineCI1.A4Trtransonic(CI1.4-1g-tg)huwndnninnt-ngativcnutantc1.ossHtransactivatortr<nsgenic(CIITA-DNtg)huttinthrn1.x>>du1.inIranSKeniCQIIBWIg)humnendothe1.ia1.protcinCreceptortraosgcnic(hEI,CR-tg)hunantissuefactorPat1.Wayinhibitortransgenic(hTFP1.-tg)hunanectonuc1.eosidetriphosphatediphosphohydro1ase-1transgenic(hCD30-t)hum11ecto-5,-nuc1.eoidasetransgenic<hCD73-tg>hmtmtUiiwurnecrosisfactor-inducedPrOIein3(1NFAII,3)transgenic(A20-ig)humnhnnwxygmnx<1transgenic<h1.MX1.-tg)so1.ub1.ehufnTJOI-FcRranSgCniC(uh1.M；RI-FCrg)W«B1.EA29Y¥因。者戒性检方法B.11.EA29TSHf1.BJtB.1.1JR以1.EA29Y葩因为杷位点，设汁上下济引物.进行J>CR检洪.B.1.2B.1.2.1样品奥相耳机娘、血液警“B.1.2.2W&X*耳样采集，采杼前对采样工具及采样部佗进行消毒,用耳标钳!«下猫耳批织，放入1.5m1.点心管中用于基因租提取.血淞采集I使用紫色采血管,采集猪全由3n1.-5m1.B.1.2.3XSttUMAtt«一用市色同因If1.DNA提取试剂盒.提取更因ff1.DNA.B.1.3PCRfiB.1.3.1引物序列1.ea29Y上游引物：5'-Gtacccaccgccatactacg-J'1.EA29Y下游引物：5,-GCGATGTCGCTGGGATAGAA-3'。B.1.3.2PCR及应体JKin程序按照表B.I配置PCR反应体察一<B.1.PeRA应体系试剂名称终浓度j11分用SHU1.)2xaa冲浪KOOBufferIX10上游;惭(K>m1.)250EK>1/10.5下游引物(IQ1m1.1.)250ra>1.0.5WKOD0.0125unit/M1.0.25HJfti100ng-500ng2d叫。补足至20H1.6.75注，反应体系中的各纲分可根据不同被终反联体系进行X分.但是需保持所有组分修浓度si.PCR反应参数:94CBi变性2min;98C变性10s,60C退火30s,68C延伸30s,32个循环:最后68。延伸5min;反应完成后在4寸保存.PCR反麻芸件随不同的PCR仪略有改变.B.133PCR1.11tt4N½制备战的琼脂的凝胶并加入染色剂，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶，将101.PCR扩增产物和2U1.上样缓冲液混合，点样，同时加入合适的DNAMazr.电压120V.电泳15min、20min.电泳至洪舒减指示剂迁移至凝胶2/3以后,但不能治过胶,凝收成像仪卜观察电冰结果并记录.B1.4实对IR检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照.采用含有1.EA29Y基因的质粒作为阳性对照，WT猪的DNA作为阴性对照，采用与模板等体积的无曲去离子水作为空白对照。B.1.5以下条件有一条不满足时,试验视为无效：a）空白对照：无PCR扩增产物条带；b）阴性对照：在573bp大小处未见PCR扩增条带：c）阳性对照：在573bp大小处可见PCR犷增条带.B.1.6结初定在符合B.I5的情况下，被检样品在573bp大小处可见PCR犷增条带则判为阳性，I.EA29Y基因整合至猪基因组上：在573即大小处未见PCR扩增条带则判为阴性.B.21.EA29Y基因SHtia定B2.1理利用1.EA29Y蛋臼与1.EA29Y抗体的特兄性结合，检测抗体酹标物或标记荧光来间接制定1.EA29Y的表达。B.2.2VestemB1.ot*S4½*B.2.2.!样品准备取适量疗胰腺组织,加入100U1.RIPA裂解液,冰上裂解30min.获得胰朦组织蛋白液.取少量细胞裂解液测定蛋白浓度（可用KA蛋白浓度测定试剂盒检测）.K222WesternB1.m实臆步|!8.2.2.2.1 SDS豪网Mgtfi电泳使用商品化预制股进行SDS-聚丙彷眺眩凝胶电泳,组装电泳槽.使用4X上样缓冲液能择蛋白样品.使稀祥后援冲液终浓度为1×.将蛋白样品和Maka上样后进行电泳,电泳完成后取出SDS-凝胶用于转膜.8.2.2.2.2 查白将PVDF股浸泡到甲醉中进行活化1min;将3张技淡用渔纸手转移谖冲液中浸泡5min;将转膜夹放于盛行IX转膜援冲液的盘中.白板（阳极）在上,黑板（阴极）在下山下向上依次放置1块海绵、2层泄纸、SDS凝胶、PVDF膜、1层/纸，注意PVDF膜和SDS凝胶之间不应有气泡，最后合上转膜夹，将其放置于转股楙中.转腰槽中加入4C泳箱预冷30min的IX转膜液，加入冰袋,彘上转眼前.然后将转腹槽放置于泡沫箱中，加入冰水混合物，以防止转漠过程中产生的热心检食电极方向并接通电源，在180m>ta流（或90Via不）条件下,我移时间为1.5h,转眼结束后,若Marker清晰可见，证明转膜成功.B.2.2.2.3«PVDf股浸入封闭液（含5脱脂奶粉的TBST）于平板播床上摇动封闭1h.8.2.2.2.4 ,一抗1««合利PVDF股浸入含适当比例抗的稀杼液中.在室温下衿门1h.取出PVDF股.浸入TBST在描床上洗涤4次.每次5min.8.2.2.2.5 2.2.2.5第二检体第合将PVDF蟆浸入含适当比例：抗的松林液中，在室温卜朝向Ih.财可完成后取出PVDF膜.浸入TBST在摇床上洗涤4次，抵次5min.B.2.2.X6显色使用市伊EC1.化学发光显色试剂盆进行雅色.使用化学发光成像仪荻取显色结果,B.2.2.3tt*M若实验娟在侬期蛋白大小的位置出现r明显条带,而野牛.型对照组在该位置无条带，则说明蛋白表达；若实验组与对照也均无H的条带，则选白未表达，B.2.3免发Ia化和免1»（光方米苓因达JK定B.2.3.1梆品准备格采集的转基因相的腆腺组织在OeT（EICCgnMicroscopySCiCnCCS.Hafic1.d.PA.USA）中包埋并冷冻，并储存在-70C,用冰冻切片机作冷冻切片（6m）用于免疫组化和免疫灵光染色.b.2.3.2兑Ina化实"步B.2.3.2.1Sft冰冻切片风干后用内用固定10minISmin,B.2.322去内IaIJI1.O.3%过氧化氢甲醉溶液或1%盐酸酒精37C作用30min.B.2.3.2.3白»化需要时用腕蛋白的消化处理，以便充分续正抗原.B2324S洗PBS没洗3次，椎次5min.B.2.3.2.55%小牛血消或1:H）稀释的正常马血清,37X?湿食中作用30min.B2326WWf加适当稀林的已知单抗或抗血清，37C湿盒中作用1h后TC过夜，B.23.2.71U%PBSi3,每次5min,B.2.328IfW二技加适当稀林的第二抗体的结合物，37C盒作用1h.B.2.3.2.9熏洗PBS洗3次,每次5min,B.2.12.10层物显色新鲜配制的DAB溶液显色5min7Omin后用PBS凉洗3次,每次5min.B.2.3.2,I1村染苏木素或甲基绿衬染细胞核或细胞所。B.2.3.2.12««常规脱水、透明、封片、显微镜观察.8. 2.3.2.13结果判定对照片本底清晰背景无才特异若染被检物呈黄至棕羯色若染，即可列为阳性。B.233R23.3.1HJt冰冻切片取出，室温放置使其干燥后，用冷丙胴于4C固定K)min。8.2.3.3.2 MWM切片用0.01mo1./1.PtK清洗后加入1.2%双氧水作用30min,以除去：|E特异染色。8.2.3.3.3 漂洗0.01mo1./1.PBS清洗，洗3次每次10min,B.2.33.40.然Tri1.onX-K)(H乍用30min.8.2.3.3.4 WW-tt加入以抗体稀秆液(含NBSA的0.01n>1.1.PBS.pH7.4)稀杼至作浓度的一抗，4C过夜。8.2.3.3.6 漂洗0.0111D11.HS清洗，洗3次，每次10min.8.2.3.3.7 -W二抗加入荧光抗体IgG.室温行2h.8.2.3.3.8 j*洗0.01mo1./1.PBS清洗,洗3次,/10min.B.2.119MRg冲甘油封片，荧光显然键下观察,B.2.3.4如果实验组视野中出现目的荧光而对照级未见目的荧光,则判断该基因表达免疫荧光鉴定阳性；若实验处和对照姐均未见目的黄光，则判断该基因表达免疫荧光签定阴性：若对照姐出现目的荧光，对照不成立,结果无意义.B.2.4E1.JSA方幽定¥因我达B.2.4JWA«*用10m1.注射器从猪的前腔静脉采集8m1.全血。取6m1.保存在促Jtt采血管内，3000rpmf心10min.分离血清,用于E1.ISA实验。B.2.4.2E1.ISA1.CIftMB.2.4.2.1海定按照陆联免授试剂盒所述操作步臊对待测试样（液）进行定Jf1.检测.B.2.4.2.2WiCIt按B.2.4.2.1所述步骡,对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行3次平行试验测定.B.2.4.2.3空白*t除不徐取试样外，均按B242I所述步骤进行.B.24.2.4砒Itfi根据待测样木中目的也门的含量，选择个合适的质控标状，以确定试险过程的操作准确性，B.2.4.3KttftAttaB.2.43.1标a曲线”按照试剂盒说明召提供的计电方法，根抠标状品质1氏浓度与吸光度变化关系绘制标Jft工作曲戏，B. 2.4.3.2伸涌液Mk浓度计，按照试剂盒说明书提供的计犯方法，将待测样品吸光度代入B24.3.1所获得标准工作曲线，计鸵恃测液质策浓度）IOW«Cggtaic.1GGTA1.WBHtMC. 1.1*三以GGTAI期因为正序列，建立PCR检测方法，并结合PCR产物SangCr涮序结果，判断GGTA1.基因融除类型.c.i.2w&a*C.1.2.1样鼻肿突猪耳姐织、直液等C.1.2.2样昌采集耳样采柒：采样曲对采样工具及采样部位进行清专.用耳标钳剪下猪耳组织,放入1.5m1.国心管中用于基R1.ai提取.出液采佻：使用紫色果血管.采集猪全血311>1.-5m1.C.1.2.3SEgfiDNAttn采用市仰葩因mDNA提取试剂盘，提取塔因祖DNA.C.1.3PCRfifiC.1.3.1引施列GGTA1.上游引物：5'-Agggacagtagacctaggaaac-S,;GGTA1.下if引物：5'GATCCTAA11WG1TGCTGCC-3,C.1.3.2PCR反应体JMn租中按照表CI配置PeR反应体系，«C.1.PGR反应体系姐分名称燧浓度姐分用H(U1.)2X佛缓冲液KODBufferIX10±iIW<1011o1.D250iwj11.0.5下擀引物（10UI1.O1.ZD250w1.1.0.5IftKoD0.0125unit/M1.0.25模板100np1150011g2dd>tf>补足至201.6.75PCR反应程序：94C预变性2nin:98C变性10s,60C退火30s,68C延伸3Os,32个循环;及后68'C延伸5min:反院完成后在4t保存.PCR反陶条件电不同的PCR仅略有改变.C.1.3.3PCRir41产金整定制备1%的琼脂施凝胶并加入染色剂，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶,将IOMpCR扩增产物和2P1.上样级冲液混合，点样,同时加入合适的DNAMarker、电压120V,电泳15min'20min,电泳至澳的蛭指示剂迁移至凝酸2/3以后，但不能造过胶.凝皎成像仪下观察电泳结果并记录.C.1.3.4KXfWT当电冰结果在652bp处出现目的条书时,将PCR产物进行DNA测序。通过比对分析野生型猪和荔因编知猪序列的差弁，判断GGTA1.基因是否融除及具体的破除类型.C.1.4实Ift对M1.检抬过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照.采用含行GGTA1.基因的质粒作为阳性对照，WTW的DNA作为阴性对照,采用与模板等体积的无曲去禹子水作为空白对照.c.1.5ABfiM以下条件有一条不满足时,实验视为无效：a）空白对照：无PCRir增产物条带：b）阴性时照：在652Hp大小处未见PCR扩增条带：c）阳性对照：在652bp大小处可见PCR扩增条带，C.1.6在符合C1.S的情况下，若基因温辑猪与野生型猪测序结果比对分析显示，域因编辑犯位产生不为3的倍数碱施的插入和缺失，则判定基因融除有效,C.2GCTA1.H因衰达JK定C.2.1*理GGTA1.基因是体内合成ga1.抗燎的关键膜,*除GGTA1.翦因后,GaI抗原表达量隘若下降,因此可以使用流式细胞术,通过标记a-ga1.抗原，检测PBMC中ga1.抗原表达量.来反映GGTAI的表达情况，C.2.2WPBMC分离液.BS-1B4.C.23样品果集使用紫色采血管采集冰全血.c.2.4QZ1.1.分离Pf1.MC使用市件PBMC分离试剂盒分奥后PBMC.C.2.4.2染色将BS-IB4按1:500的稀择比例稀补，与PBMC在4C野育30min.C.2.4.3上机检*通过流式细胤仪完成猪a-g1.的检测。C2.4.4Ia果判定若GTK。猪的PBMC标记的荧光强度显著低于野生型猪.则GTKO猪无。-ga1.抗原,说明GGTA1.基W不表达，皱除成功。考文1 £基因修饰细电治疗产品非临床研究与评价技术指导原则§2 £农业转基因生物安全评价管理办法3IS05058:1-2021Biotechno1.ogy-Genomeediting-PitI:Vocabu1.ary,4GB,T35890-2018高通址测序数据序列格式规范，5ReichartB,ctc.Cardiacxenotransp1.antation:fromconcepttoCIiniC.Can1.iovascRcs2023Feb3:118(18):3499-3516.