T_CRHA 052-2024 基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术.docx

ICS11.100CCSC(M团体T/CRHA0522024基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术Eva1.uationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhuman1.iverorganoids2024-05-20实施2024-05-15发布目次前古II引吉IIII1范国12规范性引用文件13术语和定义I4端略语25一般规定26评价内容及流程57评价报告及结果解释10附录A（资料性）S药物的肝脏毒性评价实验方案12附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告16参考文献19本文件按照GB,T1.1-2020必标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则§给出的规则起草，请注意本文件的某些内容可能涉及专利“本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国研究型医院学会肝胆腆外科专业委员会提出.本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：清华大学附属北京清华长庚医院、中国食品药品检定研究院、中国计埴科学研究院、中国医学科学院药物研究所、中国科学院上海药物研究所、南方医科大学、上海美迪西生物医药股份有限公司。本文件主要起草人：王祖芳、柳娟、明雯球、李迪'耿娱超、王晶、傅博强、磔桂芬、潘国宇、彭双清、李桦、毕出嫦。药物不良反应是个匝要的匾床问题，也是卫生系统的主要经济负担和制的行业面临的巨大挑战，弱源性肝扭伤（dmginduced1.iverinjury,DIU）是临床上以常见的约物不良反应之一，也是当前急性肝损伤最为常见的病因之一，严重苕可导致急性肝衰避、甚至死亡.目前的临床前药物试验程序难以有效的值测患者是否发生DI1.I,评价模型和技术的缺乏是造成药物研发失败率高的主要原因.采用合理、有效的模型预测药物药物相互作用及漕在D1.1.1.是制药领域面临的严竣科学挑战。传统二维培养的肝细胞（系）模型过于简单、不具法牛理特性而无法再现药物体内发生的相对杂的代谢与掰性事件,而人源肝肚类器官作为药物代谢及药物毒性预测的模型，能够更真实地反映候选药物对人体的影响，同时可以减少动物研究所致的偏差.近期,美国优品药品监督管理局发布了减少药物临床试舱前的动物试验,而鼓励微组织与器富芯）；列为替代模型的指导原则，实际上，人源肝脏类器官模型已有许多公司和机构用于药物筛选及评价，但其发屣仍存在一些技术观莅障碍。本文件的制定有助于推动法于人源肝脏类渊也的药物肝脏安全性评价的标准化建设.助力行业规范发展.I1.1.基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术使用本文件的人员应有正果实SE做实Ii1.S本文件林指出所有可幡安全使用看者责任果通的安全和urn.并保国&合有关法械定的条件.本文件给出了基于人源肝脏类器官开展药物体外肝脏毒性评价的股规定、评价内容及流程、评价报告及结果鼾择要求。本文件适用干医药企业、科研机构等试脸人员开展基于人源肝脏类器官肝细胞脂肪变和胆汁淤积相关的药物肝脏揖性评价.本文件的试验方法适用于IJN1.板，其它孔数的多孔板可参考本文件。卷引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注口期的引用文件，仅该日期对应的版木适用于本文件；不注日期的引用文件，其展新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT16&!6.52017医疗器械生物学泮价第5部分：体外细胞毒性试验（ISO1（1993-5:2009）TCSCB00082021.原代人肝细胞3*三*½X下列术语和定义适用于本文件，3.1AJKSff1.t类*hun<anIiVerOMinTd通过多能干细胞、组织前体细胞或者成体细胞，依靠细胞自组装能力构建的三维细胞结构，它具备类似于人类肝脏的生理结构和功能,并能提供更准确和可维的体外实脸模型。注：人源肝脏类器官可被用于评估药物对人肝脏的毒性影响,可以更好地预测药物的代谢途径、药效和毒性反应。3.2药源性肝捐伤drgi1.ud1.iveriijun;D1.1.I由药物及其代谢物引起的肝细胞损伤和，'或坏死，进而导致肝懒升高、黄疸、肝功能衰竭等肝功能异常表现.3.3肝脏毒性评价Iwpatotoxidtve¼u1.uat>o<用来评怙某种物质或药物对肝脏功能的潜在危害程度的过程。这种评价可以通过多种方法进行，包括体外实验、动物模型和临床观察。3.4剂量反应关系dos。responsere1.ationship药物解第剂业与生物效应之间的关系，通常使用剂量反应曲线来描述.3.5对fiK18contro1.group在进行肝脏毒理学评价时,为便于与实5金组进行比较而设立的一组参照物质或实5金样本.它是一种不含受试物的介质，在进行受试物处理时放置于与试脂样品相同的器InI中,并在与试粉样品相同的条件下进行处理，3.6实3样本experimenta1.samp1.e在肝脏毒理学评价中用于进行分析、观察和5金证的被沏试物质或物体的代表性样品。3.7MMS*31.ventb1.ank为检i«实骁中可能产生的笄景噪苦或误差而设货的，不含待测物或对照品的介质，用以确保实蕤结果的准确性和可施性.来源：GBT16886.52017,3.3,有修改4语下列缩路谱适用于本文件.A1.B白蛋白(A1.bumin)A1.T谷内转我的(A1.aninetransaminase)AOP彳f害结局路径(AdVCrSCoutcomepathway)AST谷草转凝fi(ASPartatetransaminase)QFDA5-氯甲基荧光素皤酸图(S-ChIOtun?Ihy1.1.'Iuorcsccindiacetate)CYP$细胞色素iP450(CytochromcP450enzymesyscm)DMOS二甲基亚SM(Dimethy1.Su1.foxide)FBS胎牛血清(RHbovinesern)GSH谷胱甘肽(GIuta1.hione)HCS的内涵筛选(Highcontentscreening)MMI1线粒体膜电位(MiIoChOndria1.mCmbranCpotentia1.)P/S-竹毒素-钺有素(Penici1.Iin-StreiMomycin)ROS活性氧(Reactiveoxygenspecies)5-51三U试剂选择如下:a)细胞活力检测试剂应使用细胞活力检测试剂盒：b)生化指标检测试剂应使用谷内转氨制A1.IYGPT)试剂食和谷孽转找除AST/GOT)试剂盒：O生化指标检测试剂宜根据肝脏损伤的毒性结局类型，优先推存抽测细旭活率、细照揩亡、脂肪性病变和胆汁淤枳，1个肝毒性评价指标，主要检捌指标及对应检测试剂见下表】。衰1HCS试中此取册聊ttwm*Detect100indicator烫光探针F1.grcentprobe叱班长/发射波长Excitationwav1.m<th/三issiQWve1.ength细息活率Ca1.CeinANHthD-I495/515n11reen)495/635rm(red)加飒阳亡Ca5pase-37502/5M1111rocn)版海面貌与微蛆期面职的比值:指滴急荧光强设IjMj1.1.织向枳的比坐Ni1.eRed54358rm(red)形成的变川管面枳Vift组织Ifii税的比值：微粗管,均发光强度CMH)A492/517n11Cgrc<n)注»犯常选用几个终点组令以获得最准确的DI1.1.料，在同时检期多个肝近性评价指标时，安未保!愫测咕!ft.针对不PI的检测指标速用不同的荧光柒1，荧光柒后的激发波长和发射波长不41我,5.2材料和培养IMIa2.1AWKIMI1.raBM人源肝脏类器'讨的细胞应选用来源于肝细胞系（包括但不限于Huh7.HepG2-C3A.1.O2.HcpaRGh原代肝细胞、原代肝细胞衍生的肝细胞、干细胞分化来源的肝细胞等新型肝细胞体系，包括但不限干：胚胎干细胞或诱导多能T细胞分化来源的肝细胞：直接转分化肝细胞：一退分化形成的肝细胞Pm1.iHH.5.2.2 MWm待测药物的准备应按E人用药品注册技术要求国际的调会ICHV方协调指导原则3,其工作时的最高浓度设置应符合以卜要求：不受溶媒或培养液中的溶解度限制时，最高浓度是1mM或0.5ng1'm1.（选择其中较低者）；受到溶解废限制时，最高浓度应采用培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度（若其不干扰评分）。通过肉眼或光镜检杳等方法对沉淀进行评价，来说明在培养过程中沉淀持续存在或出现（至给药结束）。5.2.3 iMMSM应选取适当配方的、含有必需泮养物和辅助因子的细胞培养呼，用,支持人源肝脏类器官的生长和维持,包括：0.05%胰蛋白酹-EDTA用于人源肝脏类器官的择放和分离，磷酸缓冲液（PBS）用于洗涤和处理人源肝脏类落官样本，蒸饰水（或任何适合细胞培养的纯化水）用于制备培养基、溶液和洗涤人源肝脏类器官.5.2.4 培养!应选用适用细胞培养的器皿，包括但不限T：玻璃培养皿地料培养瓶或塑料多孔培泳板微限滴定板96孔i1.的细胞培养线孔板,注：只要符合组织培养的要求,并可以用于动物细胞的培养,其他孔板（如384孔板、24孔板和6孔板）也可以昔代使用。5.3仪。5.&1ttffM稳定的温度（37七）、稳定的CO2水平（5%）、较高的相对饱和湿度95%）.6.3.2多功能标仪适用丁96孔板培养器皿、波长范困：400To（X）nm、带有发光检测模块。6.3.3高内聊皿分析加ft或荧光而内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜应符合以卜里求：一高内涵细胞定量成像分析系统,包括全自动高速显微成像、全自动图像分析和数据管理.一荧光显微镜，包括光源、源板系统和光学系统。一系统和显微情的激发波长范围为355-675nm,发射波长范围为430-760nm.5.3.4应符合以下要求：一加速度大于等于2000ref;离心力1.OOOro.000ref.1.1.1 工作台或生物安全柜应提供高效的环境净化,包括无菌空气过泄、消毒和防护机制.以确保细胞培养过程中的无菌操作和确保细胞及操作者的生物安全。5.3.6 MU三1IWM应具有高分辨率和高清晰度（10倍、20倍、40倍或60倍物情），能纺显示微小组织结构和细胞:配备有高质肚物镜和目祗5.3.7 实险取平应使用电子式天平量程为0.1mg-2&分度值不大于Ing5.3.8 电子例触修皿Ia出M1.应能够快速、精准地W数细胞数t并其名高度更且性和准确性。5.4准备工作5.4.1 评价方案准备开展药物肝脏毒性评价前应制定评价实验方案，方案内容及格式参见附录A.5.4.2 海成用砌帆.5.4.2.1 CTC试剂盒应按以下制制Hh1）将试剂盒放置在4'C过夜，使试剂缓慢解冻；2）在使用前将试剂置F22C水浴中约30min,将其温度平衡至室温；3）颠倒内容物轻轻混匀，以获汨均侦溶液，5.4.2.2 A1.T*ASTIWW应按以下步准备；D使用前将试剂设于37C水浴中预热约30min;2）顺倒内容物轻轻混匀,以获得均质溶液。5.4.3 CaktinAMZEtIM1.试剂应按以下步准备:1）-20'C潮光保存，2）使用前用预热好的无由济细胞培养址或PBS稀杼储存液配制2MCakdnAM和1UME1.hD-I的染色工作液，5.4.4 Qu*37M应按以下步准备：D用DMSO配制2mM储存液:2）使用前用预热至37C的无血清细胞培养基或PBS稀补储存液.终浓度为20011M.5.45Ni1.eRed似下步»B各，1）用DMSo配制I1.mM储存液;2）使用前用预热好的无血清细胞培养培黜BS稀祥储存液，终浓度为20（HO（X）M5.4.6 O三试剂应按以下步D三备：D用DMSo配制】0mM储存液：2)使用前用无血清培养基稀释慵存液至工作液浓度(0.525M),并将探针工作液于37C预热。5.4.7 桶N药物准备应按以下步骤准备：根据药物说明书,使用适当的溶剂将待测药物完全溶解，配置成一定浓度的储备液：通过文献检索等方式，确认待测药物的最佳浓度范围，并在此范围内至少设计5个浓僮梯度,同时设对照组：一如果药物需冷冻储存，避免3T个以上的冷冻./融化周期：准备不含药物的对应溶剂用于溶剂空白对照。5.4.8 仪今备在测定前确保的标仪读数的致性、高内涵细胞定6成像分析系统或荧光显微镜等仪器运行正常,66.1 DnJ肝毒性评价指标主要的DnJJH诲性评价指标包括：细胞活性。通过评估细胞活性，可以了解药物时肝细胞代谢活力和功能状态的影响，若细胞的活力低于对照空白组的70%则可以推断该药物可能具有潜在的细胞毒性效应，并据此来西里它对肝细胞生存力的具体损害程度：生化指标。生化指标A1.T和ASr是反映细胞受损程度的重要指标，可坪估其对肝脏健康的潜在影响；细胞活率。细胞活死评估通过考虑细胞死亡和存活的比例，能好评估药物时肝细胞的毒性效应；细胞弱亡.细胞制'：的程度可以耐抑胞程序性死亡的程度，足肝毒性的巾要指标之一：一脂肪变性，反映肝细制尚质代谢素乱的指标药物引起的脂肪妍可能与肝脏损伤相关：胆汁淤积。胆汁淤积相关的指标对于鉴别是否存在胆道系统的损伤以及病情严重程度具有重要意义.在坪价药物肝毒性时,还需要考虑其他因素，例如药物代谢能力、细胞通透性和药物在体内的输送等。6.2 Ift作流程药物时人源,肝脏类器官的毒性特征主要通过细胞活力读数，生化指标，以及细胞活率、细胞制亡、脂肪变性和胆汁淤枳这4个评价指标来进行表征.流程如图1所示.图掾作丽6.3人则跑，育培养板准备63.1选用的人源肝脏炎器官应符合TJCSCBo8-2021中5.2要求，肝细胞的培础形态与功能属性，比如蛋白质分泌、代谢解春等,应达到必要的安全标准.合格的人源肝脏类器官应满足以卜条件：a)AI.B阳性细胞比例290,同时HNF4A阳性细胞比例N90%;b)白蛋白分泌H800n01O6细胞，21.h);c)药物代谢前功能活跃，以CYp3A4为例，其对6-CH零耐的内在消除率需不低于100U1/(106细胞h):d)经检测确认，无细菌、真的、支原体污染,并且对HIV、HAV.HBWHCV、HT1.V.EBV、HCMV,TP等均为阴性。6.3.2 将符合要求的人源肝脏类器官接种于96孔扳，应确保每孔接种细胞的一致性,每孔200U1.培养基，确认人源肝脏类器官的细胞生长状态良好.6.3.3 人源肝脏类器官培养板的布局应按以下要求操作：a)96孔板的边缘孔不接种细胞,并加入100U1.的PBS.防止培养基蒸发，影响人源肝脏类器官的生长以及影晌待测药物的浓度：b)如图2所示.在板的第二列中,只加入培养基和相应浓度的待测药物,不加入细胞。同样地，在第九列中，只加入培养柜和相应浓度的阴性药物，不加入细胞，作为溶剂空白样本。这样做的目的是为了排除待测药物可能产生的背景噪音。C)板中除边缘孔.均加细胞,如图3所示.注：其中板中涉及到的无肝毒性药物制性药物)主要包括：阿司匹林(ASPirin.ASP)、安倍生坦(AmbriSenIan.AMB)、普奈洛尔(ProPrano1.OIFRO)、华法林(WarfrinWAR)、罗格列酬(RoSigIitaZOne,R1.Z)等。I醐闽闽国醐(1醐国C1倒画画画阑阑C©【】XxxxXXXXX】皿人毒肝脏类培界检布局tf图3人JRm类培养植布局糠&4药榭姆WHm类殖&4.1MImDwe待测药物加样板的将本设计见图I、图5。fH1.200U1.的特测药物，笫二行为对照组，只加不含药物的培养携；从第三行至第七行为药物由低到高的5个浓度悌度（具体浓度梯度要根据该药物的实际使用浓度来设置）。CDOOOOOOOK网闽闽网阉阑网gC©闽回闽阑碱01阍阉碱【】：Q1.C1.C1.1.C1.QtC1.C1.OgHWWWMI加布Je«留渊|药物加IMfi布局一板6.4.2MMHJUFENr应按以F步频掾作r1）用200I的吸头将人源肝脏类牌窗培养板中的培养基吸走KK）PI；2）按图I和5所示，每孔加入100UI相应的2倍浓度的药物溶液；3）将加入药物的加样板置于培养箱中培养24h,4）24h后，用显微慢或高内涵细胞定盘成像分析系统在明场下检查人源肝脏类器官，观察并记录其组织结构、细胞形状、细胞核形态、组织密度以及组织的完整性。注：不同时用的三次市发试脸，药物溶液霜要戒断配制，&51.1.1 添加CTG试剂应按下列步骤加入CTG试剂：a）准备不透明壁多孔板，多孔板必须与所用的发光检测仪就容；b）吸取待测药物加样板（板）第二列至第五列，以及第九列至第十一列中100U1.含有人源肝脏类器官的药物溶液加入不透明壁多孔板对应的孔中：C）将板及其内容物平衡至室海（22-25C）约30min:d）添加与鹤孔中待测药物溶液等体枳UOOUD的CrG试剂：e）充分混合5min.使细胞裂解：0将培养板在室温再孵育25min.以税定发光信号，1.1.2应按下列步骤使用陆标仪测量CTG发光值：a）在每个将测孔中确保没有气泡.b）设置悔标仪，以记录个待测孔的发光值.c）确定背景发光值，记录第二列不含有细胞只含培养基的对照孔的发光值。d）确定读数时间，每孔整合读数时间设为（0.25-1）S可作为设置参考.O等待适当的反应时间，以便反应达到平衡状态，然后记录每个孔的发光值.6.6 嘉定生化指A1.T和AST转移6.6.1 A1.T/AST标准曲线应按照以1'步螺制备A1.T/AST标准曲线：a）准符一系列浓度的丙嗣酸钠标准溶液，浓度分别为0、2、4、6、8.10U咖1/1.每个浓度配制20n1.b）在96孔板中按照以卜顺序加入试剂：每孔加入0.1InO1.1.璘酸缓冲液5小：-按照枷梯度，曲分别加2Um1.111.闻瞰渊雌溶2心、4uh6k81.IOpI;每孔加入基质慑冲液18U1.、16山、14山、12出、101.:每孔加入2,4-二硝基苯跳20P1.c）将96孔板枝轻水平热动，使溶液混合均匀。d）室温放置15min.e）使用院标仪测晶每个孔在波K为510nm时的吸光度假.6.6.2各孔吸光度回去零孔吸光度,所得差减为绝对OD值作为横坐标对应的丙阳酸钠浓度作为纵坐标，绘制标准曲线.6.6.3 Iat清中A1.TKnAST需定应按照以下步骤测定细胞上清中A1.T和AST:a）准备僦标仪检测板,b）向前标仪检测板的测定孔和时照孔中加入201.已预温至37°C的A1.T或AST暴质液，将5U1.待测药物加样板（板）第六列至第八列中的待测上清加入测定孔中,混匀后在37°C下孵育30min.c）向每个孔中加入2。P1.二硝苯期液，对照孔中加入5P1.待测药物加样板（板）第六列至第八列中的待测上消，混勺后在37°C下孵育20min.d）向每个孔中加入200H1.浓度为0.411n1.1.的乳弱化讷溶液，混匀后在室温下招有15min*O在波长为510nm的条件下，使用御标仪测定各个样品孔的光密度（OD）值.6.7 评价黄16.7.1 利用费凭分有姗博育人珈Mft育待测药物与人源肝脏类器官共培养24h以后，用PBS洗涤1次，为防止人源肝脏类器官的损失，每孔剌余100U1.的PBS.加入探针染料.按卜列步骤进行染色：a）1.ivedead染色D在药物加样板（见图5,板）的第二列至第四列加入100U1.含2X的Ca1.CeinAM探针2PM）和自h>1.探针（4M）的无血清培养郴7C（避光）再向30min;2）用无荧光探针的空白培养基进行多次Hi”半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰：3）每孔加入1001.H含2X的HoeChSt（Iog'm1.）的无血清培养基37C（避光）孵育10min,b）Caspase-37和NiIeRed染色D在药物加样板（见图5,肝脏毒性检测板）的第五列至第七列加入100U1.含2X的Caspaw-3/7探针（200nM）和Ni1.eRed探针（5UM）的无由酒培养基37C（避光）再育30min:2）用无荧光探针的空白培养基进行多次理发半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰：3）每孔加入100W含2X的HOeChWIom1.）的无血清培养唯37C（避光）解FnQmin,C）CN1.FDA染色D在药物加样板（见图5,肝脏毒性检测板）的第八列至第十例加入100I含2X的CMFDA探针（30PM）的无曲洁培养基37C（避光）督育30niin;2）用无荧光探针的空白培养基进行多次求"半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰：3）在无血消培养基中孵育45min:4）每孔加入100P1.含2X的HOeChSt（IOHRZn1.D的无血清培养基37C（避光）再仔10min.e.7.2%三m用无荧光探针的空白培养基进行多次理复半数焕液操作以去除未结合游离探针的干扰.6.7.3 %nm使用高内涵细胞定M成像分析系统或荧光显微镜的对应通道对人源肝脏类器官进行成像，其中Ca1.ceinAM的激发波长/发射波长为495/515nm、EthD-I的激发波长/发射波长为495/635皿Caspase-3/7的激发波长/发射波长为50250nn、NikRCd的激发波长/发射波长为543/598n11CMFDA的激发波长/发射波长为492/517皿Ibechst的激发波长/发射波长为）16/4601111）.&8则!分析&&1«1脑活力分析a）计算CTG法细胞相对活力，见公式（1）:RCVWR期曲组引空白）AFI总照组节空6）X/侬（1）式中：RCV:细胞相对活力：FI加药组：具有细胞、Crc试剂和药物溶液的孔的发光值：F1.空：具有培养基和CTG试剂而没有细胞的孔的发光值；FI对照组：具有细胞、CrG试剂而没有药物溶液的孔的发光值：b）使H1.EXCd或G111phPadPriMn绘制制种筠物的样品剂盘反应关系曲线.&&2生化指揖分析6.&21计IWUI上演A1.TD根据6.6.1中所测标准曲线,按照试剂盒说明件提供的计算方法进行计算:2）使用EXCeI或GraPhPadPrism绘制每种药物的样品剂史反应关系曲线.6.82.2计算蒯I1.h清ASTD根据6.6.1所测标准曲线,按照试剂盒说明书提供的计算方法进行计算：2）使用EXCd或GraPhPadpriSm绘制每种药物的样品剂值反应关系曲线.6.8.3多套敷分析6.831使用育内BB像分析软件或者ImageJ软件定量每个视IrF各遢道（CaICeinAM、EthD小Ni1.eRed.CISPaSe-3。、CMFDA和HOeChS1.）阳性（染色）细脆的数量和荧光强度，至少计数25个税野。应计以以卜内容：i）计算活细施数i与死细胞数量的百分比，见公式（2）:X=NCakCinAMR1.NHhD1.PC×IOCT（2）式中：X：活细胞数我与死细胞数量的百分比：NCJeinAM_PC:活细胞数量：ND1.D-IF:死细胞数陆2）计舞Caspase3/7阳性（染色）细胞的平均荧光强度.见公式（3）:RCMHWr7-IiC俨wm3>,1.,:HCiSM*3"+:CaSaSe-3/7阳性（染色）细胞的平均荧光强度：RCiw*r37总：Cg-3/7阳性细扭的总荧光强1%S:微祖织的面积3）计算NiIeRCd阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（4）:F1.M1.eRCdsRMkRciX）>>MK.*“-”！/O式中：HNi1.cRcd+:Ni1.eRCd阳性（染色）细胞的平均荧光强度：F1.NI1.eRCd总：NikRa1.阳性细胞的总荧光强度：S:微组织的面积.4>计算CMFDA阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（5）:FXWDA.2FmRMQ，6M（45式中：FICMFDA+:CMFDA阳性（染色）细胞的平均荧光强度：HCMFDA'：CMH）A阳性细胞的总荧光强度：S:做组织的面积.6.83.2计算阳性细胞的百分比和阳性的胸的平均灵光强度（以为X±s表示），并用Exce1.*GraphPadPrism绘制待测药物的样品剂显反应关系曲线.7讦价报告及结果解骅7.1 讦价报告应记录药物评价试脸相关信息，撰写评价报告，评价报告内容和格式参见附录B,评价报告内容包括但不限于：a）试验概述，包括对肝脏毒性评价的般本目的和原则的用述，以及细胞实验的相关信息，b）药物信息,包括药物的名林、理化性状、配制方法和所用浓度等，C）试脸设计，详细描述人源肝脏类器官的制备过程,药物的种类、浓度以及试脸的持续时间等信息，以确保试验的科学性和可鸵性，d）试验方法，简述肝脏毒性评价的操作步蛛和所用统计学方法，以及结果判定标准，O测定指标及设备，详细列出本试脸中测定的各指标，包括细胞活力读数,生化指标,以及细制活率、细胞凋亡、脂肪变性和胆汁淤积这四种染色评价指标的测定方法及主要检测仪器的名称和型号.D检测结果，相适当的统计表格列出各项指标的测定结果，包括细胞活力读数，牛.化指标，以及细胞活率、细胞渊亡、脂肪变性和胆汁淤积四种染色评价指标的结果.«）评价结果解读，对所使用的药物对人源肝脏类器官的毒性进行合理新样，包括对毒性机制进行分析和讨论,并提出所得结论.h）其它，包括贡献者、参考文献等内容。7.2 瑚IUM应从试验结果给出药物时人源肝脏类器官毒性影响结论，解杼肝脏损伤与剂M响应关系，给出毒性具体表现及肝脏减毒反应，解降药物对肝脏表现出的剂量依赖关系的毒性作用.附录AS药物的肝胎毒性评价实!昉案A.1本实验以HcPaRG细胞三维培葬形成的人源肝脏类器官为例，针对药物S进行肝脏性评价的实验需求，拟定如下具体操作方案.通过此评价,旨在充分了解S药物对人体肝脏的潜在毒性，并为相关领域的研究提供实证支持。A.2材料和方法A.2.I侬用此标准评估S药物对人源肝脏类器官的肝脏揖性作用。A.2.2试剂A.2.21礴活力检窝试剂Ce1.1.Tiier-GIoQ1.uminescentCe1.1.Viabi1.ityASsay（Ce1.ITiterGtoQ发光法细胞活力检测试剂盒,简称CTG）A.2.2.2谷丙转轨葩（A1.T/GPD试剂盒和谷草转氨除（STG0T）试剂盒A.2.2.3用于细胞影像检测肝毒性筛选的检测试剂检涌指标Detectionindicator荧光探针F1.uorescentprobe激发波长/发射波长Excitationwave1.ength/esissiwave1.ength细胞活率Ca1.ceinAMEthD-I495/51511m(green)495/635nn(red)细胞超亡Caspase-3/7502/530nra(green)脂洸面积与微组织面积的比做：膈酒总荧光强度与微如织面积的比伯Ni1.eRed543/598n三(red)形成的微胆管面枳与微组织面枳的比值：微胆管平均荧光强度CMEI492/517tun(green)A23材料a）构建人源肝脏类器官的细胞：HepaRG,无支原体污染b）特测药物：S药物c）Wi1.1.iams,EMCdiUm培养基（不含谷城施胺）d）FBS（胎牛血清）¢）吉蠹素O锥霉素g）0.05%胰蛋白险-EDTAh）璘酸缓冲液（PBS）i）蒸储水或任何适合细胞培养的纯化水j）谷氨配胺k）胰岛素D氧化可的松儿24仪。见第7章。A.3准备工作3.1.（K述所有涉及的溶剂（培养基以外）、玻瑞跳皿及其他实验材料部应进行灭菌处理，以防止细菌和其他微生物的污染。此外，所有操作都必须在无菌条件下，使用符合生物安全标准的无菌操作台进行，以确保实脸结果不受到外界干扰因素的影响。A.3.2培养*用于培养HePaRG细胞系和人源肝脏类器官的培养基：10%胎牛血清（IHS）:90%DMEM;1001U/ni.青霉素：1MgJm1.链森索；-2mM谷氨醍胺；5Nnm1.朋岛索：0.5制级化可的松。A.3.3WMtnA33.1Gtt黛苏和墙界a）从冷冻细胞库中取出需要恢亚的细触样本,并放置于低温水浴中快速解：b）将败解后的细胞转移到含有适当培养基的高心管中，并进行融哲离心使细胞沉淀在您心管底端,去除上清液：C）用5m1.培养将（I仍FBS）重悬细胞，并转移到10Cm的培养皿中，放置在标准培养条件下的培养箱中培养：由每两天用PBS洗:三次细胞,并换液。注：发苏后的第一代培养过程中，细胞可能生长缓慢0所以一旦更苏,在实般之前细窗要传代至少两次。A.3.3.2«MtRa）用PBS洗涤3次细胞以去除细胞外活性物质和培养基残留.b）加入适量的假懒，进行细鼬消化.在消化过程中控制消化时间,待细胞在显微镜下呈现圈缩时停止消化，并加入含RS的培养基以终止消化。C）用吸管粒转吹打细胞，将细胞从培养皿中吹打下来，并将细胞和培养培等混合物转移至离心管中。注意避免吸入过多液体，以免影响后续岗心效果，由迸行轻柔的离心，般建议采用400E岗心2min的程序。过程中应尽同避免离心速度太高，以减少对细胞的机桢损伤。e）弃去上清液，用新鲜的培养基Ift新悬浮细胞，使细胞能够恢宏生长并维续进行传代培罪。D选择1:4或1:5的比例来进行传代，以确保细胞住新的培养条件下能够获得更好的生长状态.注：细胞传代培养通常应该控制传代次数不应超过3个月,以避免细胞发生异常。A.3.13*H胞生长状态期a）取生长状态良好的细胞.果用一股传代方法进行消化,制成细胞悬液：b）计数,精确地将细胞分别接种于2130个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜）.每瓶或孔细胞总数要求一致,加入培养液的量也要一致：C）每天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养7天。出以培养时间为横轴,细胞数为纵轴（对数）,描绘在半时数座标纸I'.连接成曲线后即为该细胞的生长曲线，并通过统计学方法对数据进行分析，得出细胞生长规律，生长曲线斜率即为细胞生长速率。按照92币的步骤用不同浓度的待测S药物处理人源肝脏类器力21h用显微镜或高内涵在明场卜检变人源肝脏类器官，记录下细恂的状态和形态，A-6评价S药物对人寡肝!类育的肝脏毒性作用a）按照9.4章使用细胞活力试剂CTG处理人源肝脏类器宜,检测人源肝脏类涔官的活性.b）按照9.5章使用A1.T和AST试剂盒检测人源叶脏类器官的培养上清检测人源肝脏类潜盲的受损程度.c）按照9.6章使用Ca1.CCinAM探针和EdDI探针、CaSPaSC-3/7探针和Ni1.CRcdW.以及CMFDA探针处理人源肝脏类器官,利用高内涵成像系统或荧光显微镀的对应通道对人稼肝脏类器甘进行成像，多参数评价药物S的肝脏毒性.A.7敷蠹及评价续累解谀见附录B,附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告BJ试验期述本研究的主要目的是评估S药物对人海肝脏类器官的川脏毒性作用.以HePaRG培养出的人源肝脏类器官为实验对象，使用不同浓度的S药物进行处理，通过细胞活性检测，以及细胞死亡、细胞凋亡、脂肪变性以及胆汁淤枳等多参故评价方法，进行全面的肝脏揖性普伯.8.2 药物信息根据药物说明书用培养基充分溶解S药物到储存浓度IOmM。本试检中的使用浓度分别为：1.92M.9.6M.HX>M.44UM.1500M.8.3 试验设计见A.4章.以卜是用IkPaRG培养的人就肝肺类器盲的质控结果：a.A1.B阳性率:98%.HNF4A阳性率:95:b.白蛋白分泌：100Ong（106细胞24h）;c.药物代谢梅功能.内在消除率：280U1.（106细胞h）8.4 试脸方法见ASA.6章。8.5 测定指标及设备测定指标见第IO章.本试验中检刈用到的主要仪涔是：Si内涵图像采集分析工作站，T7820,使用OPerattaHigh-COntCntImagingSyStem获取细胞球图像,harmonySOftWarC分析数据.B.6榜测结果1.1.1 S药物对人源肝脏类翳言活性的影响通过用Ce1.ITiterYIO发光法细胞活力检测试剂盒检测不同浓度的S药物和ASP（阴性对照）对人源肝脏类器官的影响，结果如图B.I所示，附着S约物浓度逐渐升高，细胞活力逐渐下降，S药物的ICSO值为2.6151.*M.一心除1棚心IHit*Gb发柳拉活力分析方法分析不同浓蜘瞰对人硼朋类器醐的细超初.1.1.2 S药物对人源肝脏类器官生化指标的影响通过用A1.r和AST检测试剂盒检测不同浓度的S药物对人就肝脏类器官生化指标的影响,结果如图B.2所示，陨着S药物浓度逐渐升高,A1.T和AST择放盘U若增加。西MMtNS物WfIm匐SA1.mN的"1.1.3 %我评价药的肝毒性为了探索S药物相关的肝用性的潜在册伤途径,Hf人源肝脏类器口法型于6种不同浓成的S药物21h后，用选定的荧光探针染色用广高内涵分析，培于获得的共聚焦图像，对3D层扫图像多层挣加后计算每个参数的指标.b.63.1SKtt对人珈ffHMHg活率的影响用CH1.CeinAM探叶和E1.hDT探针则育不同浓度的S药物处理的人源川脏炎器官，使用高内涵成像并使用高内涵分析软件分析数据，结果如图所示，1.*S药材浓僮逐渐升高，人海肝脏突器盲中的活细胞与死细胞的比例显著降好.闲BUtS辍H1.Uro«后制U3死百分比与代裁HB像a6.3.2用CasPae3"探针和NiIeRCd探针的育不同浓度的S药物处理的人源肝脏类滞官，使用高内涵成像并使用高内涵分析软件分析数据，结果如图所