先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的建立.docx

先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的建立（先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的建立#林琳，宋宇鹏，潘博，蒋海越，韩娟*（中国医学科学院整形外科医院，北京100I44）摘要：目的筛查先天性小耳畸形患者整个基因组存在甲基化水平异样的CpG岛和CpG位点及其相关差异基因，进而探讨基因甲基化水平的异样与先天性小耳畸形发病之间的关系。方法收集我院先天性小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨组织为探讨对象（试验组）3例，非耳畸形（耳外伤）患者的正常耳软骨组织3例（比照组）。应用Nimb1.egenCpG启动了芯片，对两组样本的基因组DNA进行全基因组28226个CpG岛扫描,筛选存在CpG岛甲基化水平差异的基因。结果试验组与比照组在全基因组范围内存在36个具有甲基化水平差异的CpG岛，其中有29个与已命名的29个基因相关。结论初步建立了先天性小耳畸形甲基化谱，发觉的36个具有甲基化水平差异的CpG岛（包括其中已命名的29个基因）可能与先天性小耳畸形发病相关，有待进一步试验验证。关键词：小耳畸形：DNA甲基化：CpG岛510ISEstab1.ishmentofDNAMethy1.ationProfi1.einCongenita1.Microtia1.in1.in,SONGYupeng,PANbo,JIANGI1.aiyue,IIANJuan（P1.asticSurgeryHospita1.,PUMC1Bcijing100144)Abstract:ObjectiveScreeningforabnorma1.methy1.ationinCpGis1.andsandCpGsitesthroughwho1.egenomeofcongenita1.microtiatoidentifytheirassociatedgenes.Todiscussthere1.ationshipbetweenabnorma1.methy1.ation1.eve1.ofgenesandtheetio1.ogyofcongenita1.microtia.MethodsToco1.1.ecttheresidua1.earcarti1.ageof3patientswithmicrotiaastheresearchobject;norma1earcarti1.ageof3patientswithoutearma1.formationsascontro1.ChoosingNimb1.egcnCpGpromoterarraytoscreenthe28226CpGis1.andsinthewho1.egenomeofbothexperimenta1.groupandcontro1.group,thegeneswithdifferentia1.methy1.atedCpGis1.andswerese1.ected.Resu1.tsTherewerethirty-sixCpGis1.andswithdifferentia1.methy1.ated1eve1inwho1.egenomebetweenexperimenta1.groupandcontro1.group,inwhichtwenty-nineCpGis1.andswereconnectedwithtwenty-ninenamedgenes.Conc1.usionsTheDNmethy1.ationprofi1.eoftheentiregenomewasinitia1.1.yestab1.ished.The36abnorma1.methy1.atedCpGis1.ands,inc1.udingtwenty-ninenamedgenesmight,re1.atetoIhepathogenesisofthedisease.Keywords:Microtia;DNAmethy1.ation;CpGis1.and。引言2025303540先天性小耳畸形是我国重要体表缺陷之一，国外报道的发生率为0.76/万4.34/万，我国为5.18/万1。先天性小耳畸形是由于胚胎时期第1鲍沟及其邻近的第1、2鲤弓的发育异常引起的一组颌面畸形，临床上常表现为耳廓畸形、外耳道闭锁和中耳畸形。小耳畸形病因尚不明确，在以往遗传因素、环境因素探讨基础上，以环境因素与细胞遗传物质交互作用的表观遗传学探讨为其病因探讨供应了新的思路2。目前探讨最深化的表观遗传学机制是甲基化形式的遗传。DNA甲基化主要发生位点走CpG岛，大约50%的人类基因中含有CPG岛，常位于基因上游调控区的后动子区域，这些基因为管家基因或组织特异表达基因。启动子区的CpG岛通常处于非甲基化状态，CPG岛外（不在基因调整区内）的CpG位点常被甲基化。DNA甲基化是细胞开闭基因表达的一种方式，对生命过程特别重要，在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育、基因组印记、DNA突变等方面都起着重要作用。目前探讨最多的是基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（新老师20091106120052）作者简介：林琳，1976-）,女，主治医师，先天性耳廓畸形病因探讨与治疗。E-mai1.:Iynn1.in_76ahoo-1-有关肿瘤方面，DNA甲基化变更常发生于肿痛形成过程，表现为整个基因组DN低甲基化、局部基因高甲基化。先天性小耳畸形患侧组织总体表现为颌面部发育不良，与肿痛组织45505560的过度增生呈相反趋势。本探讨拟对先天性小耳畸形的全基因组甲基化水'F进行了检测，筛查异样甲基化的差异基因、CpG岛及其CpG位点，以探讨基因甲基化水平异样与先天性小耳畸形的发病关系。1资料和方法1.1探讨对象收集中国医学科学院整形外科医院术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织3例为试验对象，非耳畸形（耳外伤）患者耳软骨组织3例为比照，与供者及其家属签订知情同意书。6例样本中，男5例，女1例，年龄6'26岁，平均（1610）岁。其中先天性小耳畸形患者3例，男2例，女1例：非耳畸形患者3例，均为男性。1.2主要仪器设备NinIbIeGenCpGpromoter芯片（美国罗氏Nimb1.eGen公司上海康成生物工程有限公司供应），非接触密闭式超声波核酸断裂器（比利时Diagenode公司）、芯片杂交仪（美国BioMicroSystems公司）,GenePiX400OB芯片扫描仪（冷泉港生物科技股份有限公司），SpeedVac离心浓缩系统（美国ThermoFisherScientific公司）、Nimb1.eChipMixer（美国Nimb1.eGen公司）Nimb1.eScan软件（美国Nimb1.eGen公司）、Signa1.Map软件（美国Nimb1.eGen公司）。1.3试验方法标本取材1.3.1标本入选条件:切取的软骨组织量大于100mg;切取的软骨组织其四周软骨膜及其65皮下组织量少于软骨量的10%：选取的先天性小耳畸形患者为最常见的II度畸形：选取的耳缺损患者均为外伤且患耳无感染及软骨炎征象，视为正常耳软骨。取材后IOmin内将软骨组织于液氮中保存，无菌操作。制备CPGpromoter芯片1.3.2提取软骨组织DN,首先将基因组INA利用超声打断成400'500bpDNA片段，将其7075加热变性并将变性后的单链DNA样品分成2份：其中一份单链DNA样品加入抗5-甲基化胞朦沔定核甘抗体，运用免疫磁珠法分别样品中甲基化DN片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱，得到纯化免疫共沉淀的DNA片段(Methy1.atedDNAImmunoprecipitationSequencingMeDIP)：另一份单链DNA样品为不进行免疫沉淀的样品(乂称InPUI样品。对MeD1.P与InPUt样品进行扩增：将MeDIp(Cy5)与InPUt(Cy3)样品分别进行荧光标记后,将MeD1.P与Input样品混合、变性，与DNA微阵列芯片杂交。扫描和分析1.3.3用GenePix4000B芯片扫描仪对CpGpromoter芯片的试验组3例和比照组3例样本的基因组DNA进行全基因组28226个CPG岛扫描，用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号并输出影像，应用GenePixPro6.0软件提取数据并输出exce1.表格。依据其中一组全部高甲基化而80另一组全部低甲基化的标准筛选，确定2组之间存在CpG岛甲基化水平差异的基因。-2-序号CpG岛正常比照患者样本基因名称123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536chr1.9:3498928-3499339chr21:45719244-45720740chr1.:8008141-8009441chr2:238812331-238814639chr1.9:4494407-4495578chr2:105864219-105865009chr3:144163824-144165955chr1.5:99846383-99848131ChrY:22082427-22082725chrY:22958786-22959083chr2:87022684-87023814ChrI9:43264488-43265592chr3:46766865-46767522chrY:9295830-9296350chr1.random:343347-343805chr3:185217681-185218794chr20:59781493-59781823chr20:62032989-62033306chr3:75803981-75804596chr1.1:2774563-2774957chr19:55405442-55405885chr1.9:50786174-50786951chr5:140243269-140244338chr7:555439-556070chrY:22473488-22473786chr7:149699689-149700984chr4:170427932-170429419chr2:94900923-94901537chr1.7:7697297-7698377chrX:136475192-136477844chr1.:133945477-133945810chr1.5:75897896-75899908chr!7:78522351-78522643chr1.9:14134429-14135173chr6:111073704-111074516chr7:583087-583372BCC5C19orf71C)H4COIJ8A1DNAJC5ERRFI1.ERG2CHES6KCNQ1.1.RG1.MYH14NCK20P3PAQR9PCDHA13PCSK6PRKAR1BRBMYIA1.RBMY1.BRBMY1.JREPIN1.RGPD1.SH3R11SIP11.3TEKT4TESSP5TMEM88TSPY3ZIC3结果2.1将Cy3和Cy5标记好的富集和未富集的6个混合样品DNA分别与甲基化基因芯片杂交。芯片扫描结果，对于某一点的信号,假如Cy3信号较强，该点多显绿色，呈高甲基化趋势;假如Cy5信号较强，该点多显红色，呈低甲基化趋势：假如强度相像，即显黄色。859095两种荧光分布匀称，片基无污染。2.2 对比试验组与比照组软骨组织甲基化芯片杂交结果，依据其中一组全部高甲基化而另一组全部低甲基化的标准筛选，发觉试验组相比比照组在全基因组范围内存在32个低甲基化的CpG岛区域和4个高甲基化的CpG岛区域，其中29个存在甲基化水平差异的CpG岛区域与29个已命名的基因相关（表1）。2.3 运用Signa1.map软件对部分存在甲基化水平差异的CpG岛区域进行分析，较直观的视察到在试验组和比照组存在甲基化水平差异的现象。以C01.18AKRBMY1A1为例，显示该基因存在的甲基化差异（图1、2）o表1全基因组中存在甲基化水平差异的36个CPG岛Tab1.Thcthirty-sixCpGis1.andswithdifferentia1.methy1.ated1.eve1.inwho1.egenome-3-图1CO1.181存在甲基化水平差异的CPG岛Fig1CpGis1.andswithdifferentia1.methy1.ated1.eve1.inCO1.181gene100图2RBMY1A1存在甲基化水平差异的CpG岛Fig2CpGis1.andswithdifferentia1.methy1.ated1.eve1.inRBMY11gene-43探讨105110115120125130135140DNA甲基化是一种重要的遗传外修饰，是表观遗传学的重要组成部分，它参加了动物胚胎发育、基因印迹和X染色体失活等过程，在基因表达的调控中具有重要作用。近年来，DNA甲基化的探讨渐渐成为新的探讨热点。各种各样甲基化检测方法被开发出来以满意不同类型探讨的要求。芯片技术的发展为高通量探讨DNA甲基化供应了新的方法。高密度的甲基化芯片是探讨全基因甲基化状态的有力工具，这类芯片可结合DMH,MeDTP或MIRA技术进行探讨获得高通量的数据结果3。本课题选用的Nimb1.cgne公司结合MCDIP技术的CpG启动子芯片，覆盖全部UCSC注释的CpG岛和全部RefSeq数据库基因的启动子区，覆盖了人的28226个CpG岛。其技术过程为：首先将基因组DNA超声打断成400bp500bpDA片段，将其加热变性并将变性后的单链DNA样品分成两份：其中一份单链DNA样品加入抗5-甲基化胞喀口定核甘抗体，运用免疫磁珠法分别样品中甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的.甲基化DNA片段被洗脱，纯化免疫共沉淀的DNA片段(MeDIP)：视须要可对MeD1.P与Input样品进行扩增：将MCDIP(Cy5)与InPU1.(Cy3)样品分别进行荧光标记，标记后的MeDIP与InPUt样品混合、变性，与DN微阵列芯片杂交；用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号；最终对杂交结果进行数据提取、标准化、峰值分析、报告4依据对高密度甲基化芯片输出结果的分析，对先天性小耳畸形残耳软骨及正常耳软骨的全基因组甲基化水平差异进行筛查，初步建立了先天性小耳畸形的甲基化谱。在全基因组范围内，存在36个具有甲基化水平差异的CPG岛，其中有29个与已命名的29个基因相关。分别为ABCC5、C19orf71CDH4、CO1.18A1.DNAJC5、ERRFIKFRG2C、HES6、KCNQK1.RG1、MYHI4、NCK2、OPA3、PAQR9、PCDHAI3、PCSK6、PRKARIB、RBMYIA1、RBMY1.B.RBMY1.J.REP1.N1、RGPD1、SH3RF1、SIPAI1.3、TEKT4、TESSP5、TMEM88、TSPY3、Z1.C3。其中TEKT4和ZIC3这两个基因的启动子区域CpG岛为试验组阳性，比照组阴性。其余27个基因具有甲基化水平差异的CpG岛均为试验组阴性，而比照组阳性。运用DVIDBioinformaticsResources6.7公共数据库对此29个基因进行GeneOnto1.ogy(GO)和KEGGpathway分析，并且运用Pubmed检索工具进一步探讨，将与这29个基因有关的文献逐一检索，依据基因功能特性认为其中有四个基因值得进一步筛查，以确定是否为甲基化水平存在差异的基因。这四个基因分别为位于21号染色体的CO1.18A1,位于19号染色体的MYH14,位于Y染色体的RBMY11,位于X染色体的ZIC3。C01.18A1基因编码XVII1.型胶原的a链，XVIII型胶原属于IE原纤维胶原蛋白，其结构与XV型胶原相像，即具有较多的胶原区和非胶原区，并且两区交替排列，基因序列分析显示二者具有较高同源性，故将其与XV型胶原共同视为依原纤维胶原蛋白中新的亚类。XVIII型胶原主要存在于肠绒毛、脉络丛、皮肤、内脏、肾脏等组织中的基底膜区，但两种亚型的分布不尽相同，有肯定的组织特异性5。XVIII型胶原与果蝇Wing1.ess信号转导途径中的卷曲受体有肯定的同源型，与血小板反应素7也有肯定的同源型，后者是具有多种生物学功能的糖蛋白，可以与多种分子结合，在信号转导中起市要作用6。内皮抑素(Endostatin,ES)最初是在小鼠血管内皮瘤细胞(EOVA)体外培育的上清中发觉，是一种血管形成抑制因子，具有强大的抑制血管形胜利能7.它存在于XVIII型胶原C端的NC1.1.区，约22kD80试验表明，ES可呈剂量依竟性的抑制内皮细胞增生,促进内皮细胞凋亡，从而抑制血管形成，有效地抑制肿瘤生长，但其机制尚不清晰9。2005年，Feng等10用兔的关节软骨细胞进行研-5-。由于正常组存在CO1.181内CpG岛的高甲基化而比照组没有表现高甲基化，表明完，发觉ES能促进兔软骨细胞的增殖,并且上调II型股原，TIMP1.和XVIII型胶原的表达。145150155160165170175180185表明ES是软骨代谢中的稳定因素。他们认为ES同XVIII型胶原之间存在自体刺激反馈机制，即它能刺激XVIII型胶原生成，进而维持软骨的稔态。它能抑制MMP9和I型胶原的表达。MMP9已被证明是打开肿瘤血管化的开关，敲除MMP9的小鼠表现迟发的肥大软骨细胞的凋亡11。Sipo1.a等12探讨表明内皮抑素延缓软骨内成骨的软骨相,从而削减骨的形成，他们认为这是由于内皮抑素能抑制血管生成引起的，因为软骨的汲取和成骨功能都依靠与血管的形成。同时，2000年13证明C01.18A1的突变导致Knob1.och综合征(KS)的发生，并认为这个基因与视网膜构造及神羟管闭合有关，由此推断出这种胶原异形体的缺乏损害了胚胎细胞的增殖及迁徙。他们经探讨发觉大多数KS病人伴有中等程度的形态学畸形，例如面中部发育不良及内眦间距过宽等，这有可能是CO1.181突变造成的。最新探讨表明ES对神经发生的不同步骤包括分化及迁徙均有抑制作用。是通过抵消神经生长因子的作用而实现的14C01.18A1在比照组中可能是表达的，同时可能伴有异样的内皮抑素的生成，从而抑制血管生成影响了软骨的产生。GO分析表明C01.18A1与细胞增殖的负向调整、细胞凋亡，细胞程序性死亡均有关，具有对其进一步探讨的意义，以证明其与先天性小耳畸形发病的关系。MYH14位于19号染色体，这个基因编码肌球蛋白结合蛋白CeMY07.MYOI5、VYH9、MYO6、MY03及MYO1.A这6种肌球蛋白基因，它们的突变分别导致DFNA2、DFNB3、DFNA7、DFNA22、DFNB30及DFN48型耳等。因为所编码蛋臼与MYH9具有高度同源性，MYH14被认为是19q1.3.33区域内最有可能的耳芸候选基因。2004年Go1.omb等15发觉其在多种人体组织有表达，在骨骼肌内表达最高：而在小鼠，发育期的耳蜗感觉区和肠上皮细胞端区亦有MYH1.4的表达。2001年Donaudy等16证明MYH1.4基因在小鼠耳蜗中表达,并对300名不同欧洲国家的耳聋患者及DFNA4家系实施了MYH14的突变筛查。他们在DFNA4连锁的大家系及一例散发病例中发觉了一处无义突变和三处借义突变，上述突变在200名正常比照中没有发觉。人们才首次确认MYH1.1.基因是DFN4型耳茬的致病基因。由于MYH14同常染色体显性遗传性耳聋的关系，不能解除同小耳畸形的联系，而且在GO分析中表明与细胞形态及细胞骨架有关，因此存在对其进一步探讨的意义，以证明其对先天性小耳畸形的产生有无影响。RBMY11基因编码的蛋白是睾丸内一种精细胞特异拼接因子，N端含有RNA结合区域，主要识别RNA茎环结构上共有序列CAUCA,C端具有SRGY盒（含有37个连续丝氨酸-精氨酸-甘城酸-酪氨酸重复序列）17.RBMY蛋白主要在生精细胞减数分裂前期表达，与多重蛋白第合物内其他拼接因子（如SRP20、S昨30c、TRA-2b）相互作用以供精原细胞和初级精母细胞养分的代谢调整18。RBMY可能是作为一种剪接因子，作用于mRN前体编辑，它可以选择mRNA前体的剪接位点，从而产生特异的11RNA;AZFb区（Azoospermiafactor,AZF人类Y染色体上有一段在无精子症或严峻少精子症患者中易发缺失的区域，称为无精子症因子区）。精子缺失患者可能就是由于一些基因的mRNA前体剪接发生障碍导致精子发生障碍U9。在RBMY基因敲除小鼠有生殖细胞发育阻滞现象20。GO分析发觉RBMY11基因与RNA剪切加工及结合、mRNA加工及代谢有关，RBMY11基因的功能表现的与软骨及先天性小耳畸形并无干脆关系，但由于在全基因组的筛查中得到的并有功能的位于Y染色体的基因仅有这一个，且先天性小耳畸形在临床上发病以男性居多，因此认为此基因具有进一步检测的意义。ZIC家族中有5种同源基因，在人类和鼠都包含有5个C2H2锌指域。人类的ZIC1.和-6-ZIC4定位于3p24染色体,ZIC2和ZIC5位于13q32染色体，ZIC3位于Xq26染色体。探讨人类、小鼠、蛙和鱼的同源ZIC基因家族时发觉，ZIC基因参加了神经和肌组织的发生、骨骼的形成以及左一右轴的建立21。在原肠形成期，ZIC基因起先在盘状神经板上表达，它向头端扩展的同时在其中线区域的表达渐弱，在神经板的边缘区域，尤其是在间脑、小190195200205210215220225230235脑、脑桥和脊髓的背角表达增加。ZIC基因表达产物的这种马蹄形分布使得神经板边缘隆起形成神经褶，进而确定神经管的背侧发育模式。SmitaM.等22通过探讨敲除ZIC3基因的小鼠，发觉小鼠表现出心脏移位，尾巴弯曲等特征，证明ZIC3与左右轴非对称有关，并且可能在这一通路上的多种层面上起作用。Kang等认为ZIC3编码的蛋白影响了斑马色纤毛的对称性23oGO分析发觉ZIC3基因与RNA的转录及代谢、DNA的结合有关，且ZIC3基因是唯一筛选出的位于X染色体的基因，而且与身体的左右轴向相关，因此具有进一步筛查的意义。4结论本文通过探讨初步建立了先天性小耳畸形的甲基化谱。发觉在全基因组范围内，存在36个具有甲基化水平差异的CPG岛，其中有29个与已命名的29个基因相关，依据文献检索及基因功能重点分析了C01.18AKMYH1.4、RBMY11及ZIC3基因特性，认为其甲基化水平异样可能与先天性小耳畸形发病相关，仍需通过分子生物学试验进一步验证。参考文献(References)1陈佳鹏,张蕾,陈功等.中国1983-1988年诞生缺陷检测实力分析j.中华流行病学杂志,2006,27(5):392-395.2林琳,潘博,蒋海越等.先天性小耳畸形EYA1.基因启动子区域甲基化初步探讨J中华整形外科杂志，2009,25(6):436-439.3孙贝娜.DNA甲基化检测方法的探讨进展U1.生命科学仪器，2009,7(4):11-14.41.ippmanZjGendre1.AV,Co1.otV,eta1.Profi1ingDNAmethy1.ationpatternsusinggenomicti1.ingmicroarraysJ.NatMethods,2005,2(3):219-224.5MuragakiY,TimmonsS,GriffithCM,eta1.Mouseco1.18a1isexpressedinatissuespecificmannerasthreea1.ternativevariantsandis1.oca1.izedinbasementmembranezonesJ.ProcNat1.AcadSciUSA,1995,92(19):8763-7.6Saare1.aJ,Y1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