免疫分型 基础介绍[1].docx

近年来白血洗的免胶分型已成为诊断血液恶性肿瘤不行缺少的亚要标准之一.早年曾用过的荧光显ts短或APAAP方法基本被废弃.国际上公认的通用的方法是流式组抱术（FCM入流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克彦抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病短抱的绢困腹和细胞浆频胆核的免疫表型,由此了解被测白血疾如胞所属细胞系列与其分化程度.1 ,流式细胞仪诊断白血法的依据FCM能快速，多整数，客观的定性又定量测定细胞腹、亚、核依抗原表达（2）至今尚未发觉白血病的特异抗原.（3）能用正常趣三的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻踪学说.即白血病细眼基因舁样.分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病.这群细胞充盈于骨髓，正常血细胞从多能干细胞分化.发官.蝴力功镣细跑的过程中,细抱找、细胞浆或跑核抗原的出慰表达塔多与刖戏趋至消逝与血细胞的分化发音阶段亲宓相关，而且表现出与组抱系列与其分化程度相关的特异性.因此，这些抗原的表达与否可作为裳别和分类血细胞的基础.白血病是造血系统的怒性肿瘤,在形态上变更虽相当大,但仍能表达正常血纽抱所具有的抗原,因而仍可依据只抗原的表达谱对白血病进行免疫分型，2 .流式细胞仪诊断臼血病的意义廿Se1.fi组抱是形态学分型的国½,FCM白血病免疫分组是对形态学分型的废撕卜充硒深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不行少的，对下列状况题义更大：用形态学.纽用化学染色不能确定细胞来源的白血病.形态学为急性淋巴细胞白血病（A1.1.）或急性耒分化白血病（AU1.）但却泛特异性淋巴细胞系列抗原械记.混合性臼而病,部分88系臼血病.目前，免疫分空对粒组用和单核雌白血病的援别祥有确定因逃.慢性淋巴钿胞白血病.:小残留白血病.（2）睢床预料；可依据抗原的表达状况预科病情的后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达,预后不好.疾病鉴利：可鉴测病程的发展,疗效,可进行母小残留白血病的桧S1.二.免疫分型常用的免疫标记与其意义1 .白血病阚冰5三T淋巴细胞白血洗：CD3、CDS.CD7.B淋巴纽抱白血病：CD10、CDI9,CD22.NKjffEffiesei1.I1.JS：CD16.CD56,CD57.髓系白血病：CD13.CD14.CD33.MPo（Sa过钠匕S6）t红白血病GIyA（血型段蛋白A1巨核细胞白血病：CD41.CD42、CD61.2 .白血病系列非特异恸i原CD34.H1.A-DR为早期细胸抗碌,无系列特异性,可与CD38联合运用于免疫分型.TS而=,干旭S8BCD34+.H1.A-DR+.CO38-.Wff1.9SCD34+.H1.A-DR÷.CD38+,而秘细胞（如早绕顺）CD34.H1.A-DR-.CD38+.3 .白血病分化阶段丽Tm5uSCD4.CD8.B细肥抗原:CO10.Cy（抱浆隰XSm1.g（表面膜免枝球蛋白ICD38和Cy1.g（施浆殛球罡白ICD11C.4 .白细胞共同抗原CD45为白细胞共同抗原，其表达在洌巴好抱最忘,单物纽泡，成熟皿0胞.早期造血细胞（b1.asts）依次减弱.红细胞（中.帙幼红细胭,成熟红细胞）不表达CD45.用SSCCD45PerCP双蓼数分析可特别简洁物福糊口血液中的原始或成熟绸抱.用两个系列哪段特异性MCAb加CD45进行三色免疫荧光染色.经FSUSSC.McAbI-FITC.MCAb2-PE.CD45PerCP五叁数分析,可特异地分析原幼白血病细抱的免疫表型而不受成熟细.根的干扰.=.白血病与海巴痫免及分型1.AM1.MO:有低的SSC和FSC.在CD4S-SSC图上出现在淋巴钿胞位置上,至少表达一特异性标记如CD13或CD116,但MPO比CD13与CD33更灵敏.一般淋系标记阴性,但也可表达CD7或CD4.TKH1.A-DR.CD34阳柱,有些探讨表明C07与CD34共衰达在AM1.且预后差.M1.:流赴M1.与MoWI不易区分，M1.-ffiCD13+,CD33+.H1.A-DR,但834½½iJ于M0,可能表达部分CDI5.M2:MO与M1的主要区分是成熟度增E.b1.asts削域，CD15蛟M1姣显舌,CD34弱于M1,CD13郁爆达强于CD33,缈数病例H1.A-DR(一),CD45-SSC图显示从徵系b1.ast区至成熟骨髓细胞区的蜘带,CtMSSSC图有助于碇b1.asts比例.M3.高理粒性,具较高的SSC,但CD45校成总C少，多数状况H1.A-DR(一)或表达百娜，CD34少于M2.TKCDI3躬(+),可有CD2表达.M4与M5两型衣型相像，但M4较M5表达更多的CD34(+),较之M(XM1.M4与MS有更大的FSS和SSC,CD45SSC图上，成熟C出现在单核区，亚要的表型为CDI3、CD33.H1.A-DR.CD14和CDI5.CD33可表达强于CD13,CD33(+CD13(-1CD34(一)很可能为M5,但只出现在少数病人中,部分MS可见CD56(+1M6:M6较少见且特征不明显，一般H1.A-DR,834.CD13.CD33阳性，CD45-SSC图显示主要为红系成份.M7:巨核殖抱白血病，在AM1.中少于1%.一般CD61(GPIna)和/或CD41(GpHb-IHa)阳性，而笛息由于血骸粘附在b1.asts上造成的快阳性,可以用流式双色分析在EDTA存在下，测Gp11b1.11a与CD34以肖9阈敷活血，J场的粘附.2 .A1.1.:A1.1.是儿童中最常见的恶性肿痛,约占全目除痴的25%,在成人,A1.1.约占急性白血病的25%,我们将A1.1.分为B祖Iff1.K生，CD10+或CD1.O-,前B如睡，BfiS1.型，T如触.B祖细雌AU.:在幼J恪)占A1.1.的65%70%,肯少年为55%60%,成人为50%.在儿童，约90%病例CD10÷.在幼J1.R有少于50%病例CDIob1.astsTSFSC、SSC很少是FAB标范的1.1.或1.2,-TdT(÷)H1.A-DR(+),CD19(+),此型又分为2个亚型,CD10+ff1.CD10-,前者预后好,多数病例CD24÷,CD34+.CD20衣达随成熟度增加而增加,B祖细施被定义为S1.g-.苗8细抱型A1.1.:比亚里约占儿SJA1.1.的2S%,纽!STS为CD19,CD24,H1.A-DR+,抱浆CD22*,CD10+,TdT随CD20变更,CD34多为阳性,前B亚组被认为比B祖型预后史龙，这与t(1;19)出现相关并由此产生E2A-PBXI附合蚤白，它的表型为CD19+.CD10+.CD9÷,不同程度CD20表达，CD34-,确认此表型有助于诊断基因上不境定的病例.BffifSSA1.1.:成熟B如的生A1.1.ttJfiA1.1.2%-5%IB轴战型A1.1.蛟之B祖如魁型A1.1.有更大的FSC和SSCz三CD45-SSC图上出现在淋巴和单核细施区域,即FAB标准的13,表型为CD19.CD20.CD22.CD24且sig(多数为IGM)多数病例CDIo+.但成熟抗原与S1.g使之区分于更早的B系A1.1.,坂少数礴B纽抱A1.1.无FAB-1.3形态.T-A1.1.:多数病例有大的FSC.SSC,在CD45-SSC图上可能出现在淋系未成和髓系未成*ff1.或单核细胞区，多数衣现为嬲亚型,最常见亚型为皮质晚期衣达,CD1.CD2.CDS.CD7.CD4/CD8双帕与极少腹表面CD3、TdT多为阳性.另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CDS.CD7、TdT强表达.«1®期亚型趣CD2.CD5、CD7、与CD3+CD4+CD3+CD8+,很少见TdT型.前T细胞相，表达CD7胞浆CD3+且无其它T妞忸抗原，T妞!蝴麻的祜征是丢失T妞胞抗原而视出其它异样抗原旭汆合型白血病：随播流式技术的广泛应用,我们发觉很多病例并不袋严格划分为港系或Ia系.真正的双表型病人多为t（9；22）或（11q23）,现在杂合型的误诊率很高.IR用导致误诊的缘由是在分析中未能解除非白纽间.过度强周羽的非特异性结合，忽视了某些抗体缺乏系特异性，最于要的系特异性抗原在B系.T系.髓系分别为CD22.83和MP0.3 .CM1.:由于慢性期显舌0三S!分化，在CD45-SSC图上除了情系细能占主尉.只显示正常告留你.CM1.可蝇诊，CM1.起病与发展相对缓慢，慢慢期的持续1年左右最终发展为加速期和总变期.流式细腮技术对急变期亚组的诊断具有极i价伯.干脆影响到治疗效果.急变期CM1.主要表现为Se系，偎为洌系.1«性急变可表现出多种形态包括未分化僦.淋性急变其典型影态特征，为CDIo-BIf1.tff1.SKA1.1.极少有T细胞型;A1.1.4 .C1.1.:C1.1.细的主要为较正常淋巴纽抱梢大的小湖巴纽抱.免疫分型主要为:S1.gM.S1.gD弱表达.B系抗原为CD19,CD20、CD43、CD79a与CDS共表达,CD23表达使得C1.1.区分于艳雌淋巴疝MU.BD（C1.1.:CD23+,MC1.:CD23-）,CD10-.CD23-、CD1.1.C和CD25、CD20用弱秘，尽管C1.1.eJf,但C1.1.病人的生存率变更很大，有染色体异标的隽预后不良，最常见的三联体trisony12.14q,I3q.Hq,免疫表型上没有特异的变更而免疫表里的变更并不是提示染色体异样.最近，有探讨表明，三娱体tnsony12与Sig、CD20越IwSffi相关，与CD23-相关与FMC7相关.B型前淋巴细胞白血病（B-DI1.）蛟C1.1.更为严般,流51卿8技术在区分B-D1.1.和C1.1.上发挥很大作用，B-D1.1.多为CD5-,822+,衣达更强的sig.MU病人平均生存率不超过5年，与C1.1.在形蓉上很58区分，与C1.1.相像有CD5÷B祖纽的，但Sig表达强于C1.1.,且CD22-.另一与C1.1.难于区分的是FCC,细施为强Sig.CDS-.CD10+.CD23+,RB系表生：对于诊断为C1.1.,CD5.FMC7.CD22与SIg,CD20异样强表表达的选例我们要考虑是否为D1.1.MCC或C1.1.的亚里（trisomy12）因为它们危绘性更大.四.流式细犒义免疫分型试轮1.样本采集、运输、保存和操作。解本类型：适用于多片临床标本，如外周血、自髓穿剌液、做!活检物、淋巴样组纬舌检物、亚液、脑脊液、皮肤、粘膜（内窥镜活检物X斑针疗剌物等等.R浙诳剂的选择：外周血标本可采纳EDTA.ACD或肝素抗温.暇如用同一份血标本做白电S计数和流式分析,则应用EDTA抗凝.骨I#芽剌可用肝素.其他体液用EDTA,ACD或肝素均可,但保存的样本活性可能会建低,EDTA的优点是成熟髓性细树里造成的损失与血/J瓶聚第较小,但细胞散射光特征丢失较肝素标本快；由于相对大量的ACD会通过变更PH而影嘀僧IM组的活性问题,通常不举荐用ACD做"运穿利抗凝剂.（3海本的保存：样本的完整性和细修甜与抗腐剂的选振运崭.保存和阻度体疏相关.志向状否下,样本应在采烫后立即进行处理W染色.砌嘛存（1小时或飒）应磔温（18-220靖时可保存血或管髓标本室源即可，有些样本可鲍4,C为使.标本保存喇间上限取决于标本美编与其保存条件.肝素抗毅的血和骨U通常可保存至4872，J时.EDTA抗凝的血和廿t可保存至12-244时.ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小时,但对于只做胞内染色的样本，可簸细胞以长期保存.但?quot;固定-染色的方法取决于要分析的抗原特住和染色方式，采纳之前逸定要图强新标本的比照和沧证明蛤.2-样本制备。弹细脆悬液的制缶血和骨町：自然单细窗息液,当有血凝块时,应用50m尼龙网过停,同时进行细胞计数和血涂片以推断靶细胞群体是否仍旧存在.Ifi级块：机械分跚口酹分别两种方.分别不仅是要获得最大产量的单细抱屈液，还要尽量保强跑结构的完整性和抗原性.大多数海巴样坦城可用温柔的机械方法快速分别，并保持收获细胸的相对完整.某型S织由于纽胞间连接紧密,需在机械分别的基地上用罡白水解购如肤笔白酶.用蚤白酶,骨髓标本亦可能因母细胞成分污染而须要葡；自化.但运用酹法确定要腌认前的运用没有变更、减弱汜抗原的表达,细胞活性没有显著降彳匕(2/别JE细施群体样本的任何处理方式都可能导致把纽地群体的丢失.所以应尽可能运用最接近陵始标本状态的处理过程.去除红纽明是流式分析要求的至少步骤.两和方法：红细胞裂阴：较隹.操作笈快.并最可倭保持原始标本的白组抱分布.溶血剂的选择应基于其选择性去除成熟红细威而三M'程度的影响其他蜘胞的恃点.最好在染色后溶血.若在染色前溶血，需确认：抗原性不被溶血过程变更；溶血剂被彻底洗去，绍旭和抗体结合的动力反应未受影附；所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性与表面标谖果.度梯度即1>:白血病母跑回收姣好并可能杼到富集,同时去除死缩抱.但费时，白血病能抱的相对顺率蛟谁分析,某些IS登细威解体可疑选择性丢先依据密度梯度原理,若白血病细贼没有与淋巴细施用像的浮力密度即可旗去失.所以用此方法时应检位各层细胞特性以防止骏胞的丢失.。脏细胞悬液样本外观：有严峻溶血和£1凝块的标本可畿会有白i三的损坏以与班跑亚群的丢失或变更,应弃用.如胎丢失IQ分布：曲认细胞形态和原始标本相像.密度梯度离心之后史应松西细胞分布.可做血涂片推®i.网胞计数醐5度调整厂家举荐的抗体浓度通融是假定吧细胞数量在正常范囹内(500,000-1,000,000/testAb).白狗用数量上的显著变史会带来染色模式的变史.而白血痫标本及常有异样的白辘数量.ita标本也可能被外冏血祸降.这些标本的细胞性可能有极大的变异.因此有些标本没有足够的细的傲流式分析,有些则由于细胞大，正常浓度下的抗体相对不足，不能饱和全部的结合位点，导致假阳性结果.所以染色前的细施计数特别必要.举荐方法：WBC<1OOOZu1.用200u1.全血并调整相应溶血剂用量；WBCJOOO-10000u1.,用100U1.全血并用溶血剂标准量；WBC:10000-20000/u1.,用50U1.全血并调整相应溶血剂用猿；WBC>2u1.,用程程至(2)(3)危围内.骨髓标本经常要在PBS1:10哂后计数.应当指出,由于不同的标本中不同系歹翔细肥比例不同,调整纽胞总数不确定合适每一个系硼异的抗体.试桧室若选择不同于厂家举荐的方法(知自己稀释抗体)，抗体确定须要进行能试以得到抗体和细胞的霰住映.0野甜：死细胞对很多抗体用而异性染色,有些抗原同时存在于拘朕和膨浆,这就使样本例S胞活性桧3S变得重要，演舲楸?顺我奔流脑骨浜痛4病原硬模用请用潞便沆?薄<龈用悔椒US辛街郑阂皇梢找领牧庾郊般跟豪?糜?®玖城1.7-AAD或EMA(ethidiummonoacide1活细胞将拒染这些染料.此方法的优势是班8S表面标记和活性分析可同时迸行.通过设门即可得到活踊的染色特性.尤其适用于高度坏死的样本.样本染色后需固定.应在加固定剂之前洗去多余的7AD,以保证区分的是固定前纽抱的死活状态.但BS前时间延长.7AAD会在固定的细胞群体重新安排，死;舌细胞的区分变睚.对于染色后常规固定并在固定后12，J时以上分析的标本,最好用EMA.EMA与死维抱DNA整定的共价结合保证了长时何固定后仍倭很好地区分回定前的死活状态.二是手工检31：运用TryPanbIUe或其他雌活性蝴.(4)ff1.胞染色重细胞表面染色大多数可帮助臼血病免疫分型的抗原而在细胞蟆上.但由于很多抗原也同时存在纽胞内，所以在细他表面抗原检测时应特殊留意保持细胞S!的完整以保证检测的特异性.例如免疫球宏白重链在钻BS内和表面的存在有誓不同的意义，检测表面标记名痛是未EB定的活纸胞.ff1.胞内染色：有强胞内特异性抗原的桧两对白血病的兔睡分型尤为重要，如TdIMPo,cCD3,cCD22,以与胞菜内Ig的表达.胞内染色的关曜是使细胞膜通透，把抗体导入帼故而不影呜细抱结均的完整性.要保证固定和造蝮的步骤不影明有关标记的抗原性以与胸体的结合.抱膜和抱内的同时染色：通常,先据8我色，固定，腴通透1用内染色.IB烬是DNA染色.固定剂和通透剂都可能对细用和参数有不同的多箪影叫,应依空状况选择.每T染色对荧光素的选择和抗体的选择而很充要,如，用于装面标百英光素应不被随后的固定和通透步要所影响，而对于胞内染色,所用的荧光素应足够小能穿透到胞妆内.3.抗体蛆合的珑定：选择抗体田合的技术性考电：基于血液肝痛的困难性,供应一个通用的抗体选择策略是不现实的.国际上迄今也没有一样性的抗体用合.应当意识到,没有一个物的既小又功能齐全的抗体担合可以解决全部的I版床相关答案,一个局限性的小组合也可能影响对样本的正确评估和分关.逸认纽胞异样的实力与所用抗体的数量干脆成正比.。婚择抗体组合的基本陵贝下：1)所选的抗体组合应足够宽，可以湖IJ样本中的全s三e亚群包店正常和异样群体.抗体的数越买，桧测的灵坡度越高,应当指出，由于8摊细抱经甯缺少细胞的正常标记或表达异样，所以特异性抗体烧定程度上的近复选择有时是必要的.2抗体的选择应可以区分正常和异样蛇施正常细胞可作为试脸的内参照,异样如的胜欣达比例也更精确.如现在用CD45抗体来区分正常和而S翅胞.此方法尤其在无趣细胞含少时更显优势，3 )荧光强度和表位密度应同时考电对表达少隹抗原关位应尽可能因耀度褒的荧光嬴4 )必要时用;甜检8瞰除死细抱较强的非特异性染色，国外统计,约70%组织样本和48%面或仲M标本有活性检测结果.5 )礴人员应了解所用抗体的反应纽抱谱,以与与特定英光素结合后的染色哽式，相同的CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式.(2滞用的方案考虑：大而全的抗体组合：全面了期抗原表达,无高级外染色.省时但赛用高.先用箍查试剂了解释本的一般状况,再依据所得信息采纳其次线相异性更高的抗体姐.足济，但酬，也须要正确的抗体选择的策略性确定.但考虑到所用时间和设母费用，只有约30%5海通合室采纳此法.发刊5床或形态学的贡料，选用有目标性的抗体组合以磅认可疑的诊断或分类.4 .样本获得通常，每个标本应荻得1-2x104个有核细胞的荧光和散射光信号/4峨余病变分析则需5x104个细胞.恶性细胞觉有较宽的大小和粒度范闽,获得时最好收集无门的纹据以保留全部未知异样细期展的全部特性.免安荧光信号要求对数放大和至少256道的跻E蟀.无论迭释减或线性放大都要以保证异样细胞都旎被检测到.5 .数驾分析只有通过多参数分析,才能最大程度地区分异质的样本中的正丽异标细胞.各参数分析敕球若综合细胞的光散射和多色荧光特征.最少的要求应是4个参政(2个光散射和2个荧光鲂数1采纳的参数越多，分析步腕困逃,流式免疫分里的灵散度越高.分析技术：数据的分析方式的样本的珞性.抗体组合与曲床状况的不同而变更.但总的原则是要用多费数的数娓创建可以区分正常和异样细胞的图形，如FSCvs.SSC,F1.vs.F1.Scattervs.F1.等，散射光与英光鲂数的综合分析经常能供应骏的值总.(2)分析步骤：首先分析全部辘的抗原表达状况，接别出正雉期胞和异样细胞群体,正常组胞的表现可以作为整个试珍染色过程的内部卷点,供应试肮一样性与否的客观证据,异样细眼则通过进一步设门分析确定表率特点.设门:即选择特殊的细胞群体分析其各个轮数的表现,是一个基本的分析技巧.把分析舄限在门内的短抱群体的前提是门内的细胞代表全83倍爱好的细胞,而且没有其他雌的污染.TS来说,不同疾病的设门策BS亦不同,常用的FSCvs.SSC的设门方式可能不总是适用于1.&1分析，如在急性白血病中，CD45和SSC幽Z拶数显示是答另抚蜘S的一个端洁而有效的方法；在B纽的淋巴Hfi中用一个全B细胞的抗体设门来看抗蜀口抗ASt的表现：T纽胞淋巴癌时用一个全T细胞抗体设门使肿«纽抱的分型更加胆媚.另外，通过组抱持异的抗原表达确定其光散射区域的backgate的方法也很好用，如通过CD14vs.CD45的双参数分析区分多个区域的淋巴、单核和粒细胸群体.（4）分析异样细献节体：确定异样细胞群体后要进一步分析其免梭分型.分析抗原表达要国意：在1.&1.中，定性的描述（阳性瞰住）通常要比阳性百分率的计宜更有价值.只有在设门内细胞全部是感受好的钿胞而且灵光分布的形态可以特别清障地区分阳性和明性亚群的状况下.阳性百分率才有意义.当然，在某些抗原异质表达的群体中，可进行定性或定量的分析（X%无理细胞CDX阳性）；百分率也可用于描述异样和正常细胞的比例.评估抗原表达强度是分析的歪要组成部分,对于一个特异的抗体而古,荧光强度是抗原宓度的反映，同时也与所用的灵光索和独特的荧光素抗体爱合物有关.有时确认异样群体是因为没有表达应当趣的抗原，但有时只能从抗陵袤达的异样强度来函.如用一些髓性抗原CD14.CD33,CDW65的相对表达强度和散射光郴ET来确认单核维胞系丽细胞系的发IS成熟过程.英比强度的评估在大多数状况下可以采纳定性的资料.但由于试剂即机器上的不同，仅仅基于荧光道数的简洁标准可能并不足够,最好以其在相同条件下相对正常侬的强度来表示.如CD45,CD8或CD38等在不同组胞上的表达施度相差几个对数范围.CD22或CD4等抗原SW在所谓阳性范围内在不同妞胞类型上的区分蛟小.区第弓阳径和明性密体：在某些状况下对诊断有较大的价值，如B细胞恶性肿瘤的CD5弱表达，但弱表达的推断却经常很琏.现行的标准如20%三生等都仍是人为的标准.依照直方图上与比照组相比向右移动来推断阳性所需的最小位移也是人为的标准.可用K-S统计来比较百方图的区分.亦可选用强的荧光染料，或用过量未标的抗体电般非特异染色，从而颉强阳性染色的祜异与否.6 .数据说明虽然对流式免段分型结果的说明最好与形态学结果综合考虑,但流式的作用仍远远多于对形态学结果的沽证明.流式可能招助形态学珑认某些诊断,也可能提出之前没有考虑的诊断,甚至在一些典生表现下流式免疫分型可以在其他方法的协助下诊断疾病,但应尽0说明任何流式结果和其他方法结果上的不一样，流式结果应与S床.形态学、细胞13传等其他方法综合考电.