免疫组化超详细步骤.docx

免疫组化一试验目的：分别用KRAS、NRAS,HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS.HRAS蛋白的表达状况二试验原理:应用免疫学基本原理一抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）.对其进行定位、定性与定量的探讨，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术.三试验试剂与耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRASxHRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS.苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等四试验设备：切片机、4C。冰箱、显微镜、烤片机五主要试剂配置：缓冲液应用液ANaH2PO438,4g配成100O亳升溶液应用液BNa2HPO412H2O114.8g配成100O毫升溶液配制Ioc1.e1.亳升PBS须要14亳升应用A液，36毫升应用B液,力口8.5gNaC1.o枸橡酸钠抗原修复液应用液A枸株酸10.55g配成100O毫升溶液应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）29.01g配成1000亳升溶液配制500毫升抗原修复液须要9亳升应用A液，41毫升应用B液，苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250亳升,硫酸铝17.6g蒸镭水750亳升.碘酸钠0.2g,冰醋酸20亳升。先将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝溶于蒸储水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最终加入冰醋酸。抗体说明书建议的抗体稀释度N-Ras1:50-1:500H-Ras1:50-1:500K-Ras1:20-1:200六试验步骤：1组织常规石蜡切片厚度3-5um,防脱片捞片后晾干，放入72b烤箱烤片2小时。2切片脱蜡水化程序二甲苯I、H脱蜡各12分钟;无水乙建I、I1.各3分钟；（洗二甲苯）95%乙醇3分钟；85W乙薜3分钟；3自来水漂洗3分钟，洗涤肯定要充分。4组织修复采纳高温高压法：压力锅中加入PH6.0,0.01M抗原修复液约100Om1.切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W,待高压锅阀门喷气起先计时，修复时间为2分钟。5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本苣于内源性过氧化物醐阻断剂3用H2d,室温放苣4分钟。（须要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。7取出切片，擦干组织四周液体后滴加10%BSA封闭液，37C。孵育40分钟。滴加一抗（浓度配比,PBS稀释1:20、1:50、1:100.1:200）60u1.,留意保持组织潮湿状态但表面不能有液体，用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触，8滴加一抗后放入专用孵育盒内.4C。冰箱过夜，9切片放入PBS缓冲液中清洗3分钟3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。（前两次的PBS倒掉）10擦干组织四周液体后滴加70微升辣根酹标羊抗小鼠/兔IgG聚合物（依据实际状况要求覆盖样本），37U温箱内孵育40分钟。PBS缓冲液洗涤3分钟x3次.11显色，滴加现配适量DAB显色剂（在Im1.试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50UI）试剂I（DAB浓缩液），混合液，即配成DAB工作液），配置DAB显色剂的容器在冰冻切片机旁边的冰箱里，其它试剂在入门口冰箱。室温显色,5-20分钟。自来水终止显色。第一遍的自来水需集中处理，自来水洗涤3分钟。12匏染.苏木素染液中染色40秒，水洗1分钟。13盐酸酒精溶液分化3秒，流水漂洗。14蓝化10秒，流水漂洗。15脱水，切片依次置于85%乙醇，95%乙醇各1分钟.无水乙醇I、I1.中各2分钟C16透亮，切片依次置于二甲苯I、H中各2分钟17中性树胶封片。