课题申请书-淫羊藿的炮制机理.docx

要，研究假说：中药经炮制后可提高活性成分的吸收,从而达到增加药效的目的.本研究选择滓羊指（EPiInCdiiJmkreunumNukai.>.利用AEME/ToX平台研究单体活性成分EpimedinA、EpiaedinB.EpimedinC.Icariin、BaohusideI的吸收、代谢机理与动力学及淫羊紫炮制品的标准提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用，从中药活性成分吸收与代谢的珀度闺明淫羊指的炮制机I也中药烟洌的科学研究起步较晚，时减毒或地效的物质基础及炮制机理研究较少.目的对中药炮捌机理的喇述只是停用在该过程的两跳即化学成分的变化和约理的效层面，而对用明炮制机理的重要环节炮制前后有效成分的吸收、代谢研究不好深入,本课时拟从更深层次上阐明中药炮制机理，同时为制定合理的炮制工艺和质量标准提高科学依据，为中药现代化、国际化做出更大贡献，（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）1 .项目的立项依据*中药炮制是我国人民在数千年的医疗实践中不断总结、改进、发展形成的一套传统制药技术.和中药史方一起构成j祖国医药学的两大鲜明特色.目前对中药炮制机理研窕所采用的方法有r应用化学方法进行研究'：中药的疗效，是由于共所含的化学成分决定的.中药经过炮制后,所含的化学成分的性防和含出会产生不同程度的改变，因而药理作用、临床疗效也会发生相应变化.可见，研究中药炮制前后化学成分性侦和含疑的变化是中药炮制机理研究的至要内容，该方法在,定程度上能用明炮窈原理，而且能指护炮制工艺的设计和改进，也是制订质状标准的重要依据。蔡宝吕等测定了马钱子不同炮制品中生物轼和日被f许的含址,表明炮制后生物碱和4钱子背的含盘均降低：蔡宝昌等从炮制前后的乌钱子中提取鉴定了16个生物碱,其中异马我广域等为新生物班：应用实蕤药理学方法迸行研究'：中药的临床研究由于受到北方用药和患者时象的制约，-殷不易进行，加上很多中药化学成分研究还缺乏与药效的紧密联系，或者尚属空白，因此实验药理学的研究也是揭示中药炮制机理的方法之】应用实验药理学的方法研究中药炮制,主要选用适合中医病理模型的方法和指标来进行,或选用已有的药埋方法和指标来进行.在化学成分不清的情况下，通过实验药理学的方法来研究炮制前后的生物活性变化，也可达到控制炮制质量和拈停1；改革的目的。如：蔡宝昌等力的研究表明马钱子不同胞制品的急性毒性较生品均行所降低：斗聃等,的研究表明草鸟用新方法炮制后具fj对心律影响小、毒性低等优点.总之，目前中药炮制机理研究主要通过炮制前后药物有效成分含软或溶出量增加、与治疗无关的成分的减少和西材中所含院的活力的破坏以保留有效成分等化学成分变化的用度和炮制前后药理毒理的对比等角度来用述.*从目前对中药炮制机理的研究现状可看出；对炮制机理阐述的过程中缺少架沟通中药炮制前后化学成分变化与药理药效变化之间关系的桥梁一一中药活性成分AI)ME/Tok系统的研究：中药活性成分吸收与代谢是中药产生生物效应的重要环节,更必彻底阐述中药炮制机理的瓜佳切入点.本研究拟利用中药活性成分细胞层次的ADME/Tox系统研究中药淫羊检的入药品种之一淫羊前(EpimediumkoreanumNakai.的炮制机理。1.3为了充分发挥药物的疗效,必须增加布效成分在体内的溶出度、择放度和吸收率，以提离生物利用度，然而药物在体内的效的发挥很大程收上取决F血药浓度的高低，而药物在生物体内的吸收、代谢与血药浓度的高低有密切关系。目前，口服给药在各种给药途径中占有主导地位,因此.筠物的ADME11ox系统研究是生物药剂学研究的重点之一ADME"ox系统区别于以前的吸收、分布、代谢、排泄的小级研究不同在于：提取与筛选同时进行.可以全面检测和预见药物提取过程中成分及在体内吸收、分布、代谢、抒泄和毒性各方面的问题；用细胞特别是人源细恂进行，来用高通玳技术时国外对药物ADMEToX系统(吸收、分布、代谢、排泄、毒理、药物一药物之间相互作用)方面的研分布常代视,从而多种研究药物肠道吸收的生物学方法直运而生.ADMEToX系统研究中最著幺的吸收模型一-Caco2模型被美国FDA认为是预测人体药物吸收的行之有效的方法，Caco-2模型辅以大鼠在体肠灌流模型可以从在体和细胞两方面全面阐述药物的ADME过程及其变化。(I)Caco2细胞模型Caco-2细胞来源于人体结肠腺痛细胞，由于Caco-2细胞在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结,其形杳学、标志碑的功能表达及渗透特征与小肠类似，CaCo-2细胞模组可作为研究小肠衣皮细胞药物转运和代谢的体外模型.其优点为:省时、可测定药物的细胞摄取及跨膜转运、Caco-2细胞内有药物代谢酸，可在代谢状况下冽定药物的跨眼转运、CaCo-2细胞与小肠上皮细胞近似'CaCo-2细胞易干培养且生命力强、GICO2细胞来源是人结肠点细胞,同源性好，可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别.CaCU-2细胞模型的域本特点Caco-2细胞系结构和生化作用类似于人小肠卜皮细胞.含有与小肠刷状缘上皮相关的酪系，与正常的成熟小肠上皮细胞.在体外培育过程中出现逆向分化(反分化)不同，Caco-2细恂在传统的细胞培养条件卜,生长在多孔的可渗透的景隙(Po1.ycarbonate)原上可达到融合并自发分化为肠上皮细胞,形成连续的项层(mono1.ayer)培育约IOd后，单层的跨度电阻约为2600。c细胞密度约为0.9X10”细胞.cm',此时CaCO-2细胞单层时漏出标志物如聚乙二醉(Mr100O)或I1.渊醉是不海透的,这种性筋可以维持恒定约20d,由于CaCo-2细胞性质类似小肠上皮细胞,因此可以在这段时间进行药物的跄膜转运实验'Q1.Co-2细胞模型的药物转运机理在Caco-2细施模型中,药物的转运过程为:药物分子从Caco-2单细施层的段例肠腔(W(AP侧)胯过Caco-2单细脆层或经由细胞间隙到达基底侧(B1.恻)药物跨过肠上皮有4条途径:被动转运；胞旁戮运;栽体介导转运;胞饮。(2)在体隔灌流模型特点：保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损，同时也保证了血液及淋巴液的供应，提高了生物活性.在该模型中还可测定肠道代谢物.该法既可从肠腔取样，又可从血液中取样.虽然这些研究常在麻肝的小动物上进行,但借助肠插管,非麻醉的实验动物及人体的淞流研究亦可进行“。在体顺道灌流不仅提供了较高的俎织活性，而I1.提供了额外的取样部位。已经建立了融肠原位灌流实腌取得的药物肠道滋透率同人体研究中口服给予药物溶液后吸收的药物量之间的关系。I1.uM.等学者采用Coca-2和肠滞流模里等方法时黄雨和类黄阴成分的吸收与代谢进行了研究E“：研究结果表明.一：黄胡甘类化合物在肠道中降解成伊元再吸收，而淫羊尔计主要是以它的次级以李触H=形式吸收。类黄丽的吸收与代谢途径可归纳为FigI*淫羊祗为传统补肾中药,在民间沿用已有千年历史具补肾阳强筋骨.祛风湿功效.临床常用于阳疹遗精,筋骨疲软，风湿榭懒等证,淫羊保中含多种黄胡类成分，目前研究证明24：滓羊靠总黄酮为淫羊精主要活性成分。淫羊於总黄雨在心血管系统、中枢神经系统、由液系统、免疫系统、抗炎、抗骨质硫松、抗衰老、抗肿病等25方面取得较大的进展.临床常见的涅羊希炮制品彳i淫羊蕾、羊脂炙涅羊希、盐涅羊素和酒涅羊茄等。目前对淫羊指的炮制研究主要有以下两个方面：(D炮制前后黄酮类等化学成分的变化陈惠玲等?采用紫外分光光度法测定粗毛涅羊素生品及4种不同炮制品中总黄丽的含求，总黄阴含量由高到低IBi序为：生品清炒品酒炙品盐炙品羊脂炙品.(2)炮制前后药埋、药效的变化淫羊希炮制忘时心血笆、中枢神经系统等方面筠理、药效较生品行显¥提裔，故历代临床用茹均以炮制品为主.淫羊转炮制处中总黄胡含址低于生丛,而临床用药历代均以炮制品为主，且认为淫羊紫炮制后药效较生品有显箝提高。因此从涅羊炮制Ir后化学成分变化的角度并不IMMI其炮制机理：对知后其药效的，强也缺乏令人倡服的储述，即只知其然而不知其所以然淫羊花炮制品中总黄眼含此低于生品,而Ifi床用约历代均以炮制品为主，即其炮制品药效发生品有髭暑提高，因此我们的假说为；淫羊的炮制机理是，淫羊炮修后能被机体Ift收的黄含量相对增加I中药经过他制，可提济活性成分的吸收，从而达到增强其药效之目的即该研究试图从活性成分ADME,Tox层次阐明淫羊W的炮制机理,以期填补国内目阐中药炮制机理研究领域的一个空白.中药炮制的科学研究起步较晚.许多炮制经验.只知道炮制后可以降低毒性、可以增强疗效，但对戒毒或增效的物质延础及炮制机理却长期处于无知状态，即只知其然而不知其所以然.目前对中药炮制机理的阐述只是停留在该过程的两端即化学成分的变化和筠理药效的变化,而对阐明炮制机理的关煜环节炮制前后中药活性成分的吸收等研究不够深入,本课题拟从更深层次上阐明中药炮制机理，同时为制定合理的炮制工艺和筋地标准提供科学依据.为中药现代化、国际化做出更大贡献.考文献1 .叶定江主编.中药炮制学国.上海:上海科学技术出版社,1996:82 .蔡宝昌等.马钱尸不同炮制品中总生物碱的测定及急性毒性试验的比较.中国中药杂志，1994,19(10):5983 .蔡定吕等.炮制对马钱子中马钱干忒的影响.中国中药杂志，1991,19(6):3464 .蔡宝昌等.凸钱子中16个生物碱类化合物''CWR谱的数据分析.西学学报.199%29(1):445 .马聘,蔡宝昌,陈龙.草乌几种炮制品的雄性实验比较.中国中药杂志，1994,19(4):2166 .王舞主编.中药研究现代方法学.北京:化学工业出版社,2001：67,杨海涛，王广基，Caco-2单层细胞模型域其在药学中的应用，药学学报，2000,35(10),797800. «,robeitAC,Phi1ipSB.Caco-2ce1.1.mono1.ayersasmode1.ordrugtransportacrosstheintertina1.mucosaJ.PharmRes,1990,7(9):902. HIjRaubTj.BonchardtRT-Charac1.erizationofthehumanco1.oncarcinomace1.1.1.i11eCac>-2)asamode1.systemforintestina1.epithe1.ia1.pcrmcabi1.ityJ.Gast .DhircnRT.App1.icationsoftheCaco-2mode1.inthedesignanddeve1.opmentofora1.1.yac(ivcddrug$;e1.ucida(ionofbiocbenica1.andphysica1.barriersposedbyt1.)eintestina1.eithe1.ium(J.dvDrugDe1.ivRev.1997.23(1):77. aHAhrcnstcdtO-Ha1.1.grcnR.cta1.Regina1.jejuna1.pcrfusion,anewinvivoapproachtostudyora1.drugabsorp<ioninmanJ.Pharmres.1992.9:1234. eM1ChenJ.1.inH.DisposidonofF1.avonoidsviaReeyding:Meehani$(icStudiesofDispositionofApigeninintheCaco-2Ce1.1.Cu1.tureMix1.e1.J.Phannaco1.Exp.Therap,307(I)314-21.2OO3bM.Sinko.PJ.DcMecre.A1.JJohnson1DAandAmidon,G1.Membranepermeabi1.ityparametersforsomeaminoacidsand-1.ac(amantibiotics：app1.ictionoftheboundary1.ayerapproachJ.T1.eor.Bio1.1.31.107-114.1998* *M.R1.and.K,Gc.1.Chcn.J.Ty1.e.P.an1.Roy.S.Dc1.crminationofAbsorptionCharacteristicsofAG337.ANoe1.Thymidy1.atcSynthaseInhibitor1UsingaPerfusedRatIntestina1.Mode1.J.Phara.Sei.,87,886-890.1998* M,ChenZ,Zheng1.Functiona1.ando1.ecu1.archaracterizationofratintestina1.*.c-pubaheadofprintPUb1.iCa1.沁n.2OO3a* ,Y.andHu.M.AbsorptionandMetabo1.ismofE1.avonoidsintheCaco-2Ce1.1.Cu1.tureMode1.andaPerusedRatIntestina1.Modc1.DmgMctab.Disp.30370377,2002fY.1.iuY,Dai,Y,Xun,1.andHuM.EntericDispostionandRecyc1.ingofF1.avonodisandGinkgoF1.dVOfKKiiSJA1.1.cm.Cmp1.ement.Med.9(5>631-640.2003PeniDcin.BWandIhiM.TheDeve1.opmentofCaco2Ce1.1.sExpressingHigh1.eve1.sofcDNA-DerivcdCytochromcP4503A4.Pham.Rcs.13J635-1641.1996.* «:J,1.inH,HuM.Metabo1.iseofF1.avonoidsviaEntericRecyc1.ingiRo1.eofIntestina1.Dispos(ionJ.Pha11nac1.Expt.304:1228-1235.2003* K,NakadaY.SuzikiA.eta1.Bi1.iarymetabo1.itesofhesprreininrats.ShoyakugakuZasshiJ993,47:43行T,KanoY,SaitoK,eta1.Urinaryandbi1.iary三etabo1.itesofdaidzinanddaidzeininR心.Biu1.PhamiBUHj994.17:136922 .李枫,刘永.宝蕾音I.VI.VII和宝蕾素的分寓和结构研究.药学学报，1998,23:73923 .邱峰等.淫羊素住在大梁体内的代谢.药学学报.1999,34(3):22222621.欧阳军,欧阳红.涅羊希化学成分及药理研究的新探讨.中国民族医药杂忐，1997,S1.:15825 .许鬻连，昊铁,王晖.浮羊希总黄酮药在作用的研究现状,中国临床药理学与治疗学.2003.8(1):11526 .除惠玲等.SI毛淫羊笊及其不同炮制从中总黄胡的含血中国中药杂志,2000.25(4):2392.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关饨问题。*研究目标：从中药活性成分吸收的角度阐明淫节重的炮制机理.本研究选择淫羊祗(Epimediumkoreanu11Nakai.),利用ADME/Tox系统研究总体活性成分EpimedinA、EPimedinB、EPimedinC,ICariin、Baohuside1的吸收、代谢机理与动力学及淫羊盖炮制品的标准提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用.从中药活性成分吸收与代谢的角度阐明淫羊策的炮制机理，*研究内容:淫羊精中含有多种化学成分，黄雨类成分是其主要活性成分，本研究拟选用浮羊瓶的入药品种之一淫羊/(EpimediumkoreanuaNakai),对其中的5个黄IW1.R体活性成分及淫羊保(EpimediumkoreamumNakai)炮制品的标准提取物中这5个主要单体活性成分的吸收与代谢及其相互作用进行研究.结构式如F：2.rha-xy1.g1.cEpiaedinB（朝一定B）rha81cEpimedinC（朝指定C）g1.cICariin(淫羊检昔)Baohusidc1（宝而昔）(1)浮羊然黄酮类成分的HP1.C和1.C-MS的分析方法：建立EPimCdinA、Epi11dinB、EpimcdinC.Icariin.BaOhUSide1.的HP1.C分析方法,井用1.C-MS.1.CMS-MS等分析手段对标准提取初中其他成分进行峰归属.(2)HP1.C测定淫羊菰不同炮制品标准提取物中EPimedinA、EpimedinB、EpiaedinC、Icariin.BaUhUSide1.五个单体活性成分的含量变化。(3)利用ADME/Tox系统研究EP1.mCdinA、EpimedinB、EpioedinC.Icnriin、BaohusideI五个单体活性成分的吸收与代谢机理、动力学、毒理学、药物一药物之间相互作用(4)研究比较生品与羊脂炙炮制晶的标准品提取物中,上述5个黄用单体活性成分(EPiBedinA、EpiaedinB、EpimedinC,Icariin,Baohuside>的吸收与代谢机理及其相互作用。*拟解决的关键问题：淫羊盖经炮制后总黄能含量降低，但是历代临床用药却以炮制品为主，本研究拟采用ADMEZrQX系统研究淫羊素加制品中黄制类成分的吸收与代谢,试图从中药活性成分吸收的角度阐述炮制的机理:炮制可提高中药活性成分的吸收.3.拟果取的研究方案及可行性分析*技术路线*研究方法及实断手段：(I)HP1.C、1.CTS分析方法：条件：色谱柱：C18柱4.6×150.5um)；流动相：A(0.5%冰酯酸溶液),B(乙脑)：B相浓度梯度洗脱：O-TOmin(25%B),2045min(25%35%B);流速：1.0nWmin：检测波长:272nm；进祥量:20u1.(2)(.aco-2细息模型研究黄成分的吸收代审，Fig2Caco-2mode1.细胞培养：CaCO2细胞种植于IranSWd1.上.种植密质为(IOaOOo细胞/cm2).培养基为含有10%小牛血清的DMEM溶液,细咆在37C的CO,培养箱中培养，网,天更换培养液，单层细胞于19-21天左右分化形成，即可用于试脸。实验过程:37下用PH7.4的HBSS将单层细胞冲洗3次,测即削I1.S电阻，弃去跨媵电阻值小于500OhmsXCm的细胞，细胞在缓冲液中孵Ff1.h后吸走典化介侦，在细胞,层的绒毛面(AP)加入含有待试药物的溶液.随后发生一系列的跨膜转运.AP侧底液干开始和结束时取样两份，B1.侧底液每隔BOmin中取样100u1.,并补充同体积空白底液保将B1.侧体积忸定。花每份样品中加入50U1.溶液(乙脂:冰甜酸=94:6,其中含作为内标物的100uM率丸雨,混合物离心(13.00Orpm)8分钟.上清液用I1.P1.C法分析.(3)大R在体单向断值注模型研究M成分的吸收代附，方法；麻醉动物,打开腹腔，靠近十：指肠处插入胆汁导管，分别在IheduOdenUm；thejqjunum：IhetCrminaIiICum：theco1.on两端插管，实验时间等滋生理盐水浸渍的纱布班靛F场组织表面以保湿，用等港生理盐水冲洗肠内容物后换灌流液,用恒速泵灌流隔腔.泵的流速为0.191m1.min.短隔30min收型出口管中潴流液,谶注前收集次胆汁样品(约0.4m1.),随后每隔30«Iin收集一份,灌注后测St小肠的长度.出口管中药物浓度用HP1.C检测。胆汁样品用镇冲液按(1:10)比例梅科，加入葡萄树酸酸陶和硫酸醋酹，反应6h.释放出普元.供HP1.C检测.撅粒体：肠微粒体制茶：大鼠禁食24h,不禁水，注射茶巴比妥钠(200m,'k)处死，切开8只鼠的小肠部分，按照以下的方法分离：小肠部分(始端IOCm作为十二指肠：末端IOCa作为回肠:其余的作为空肠)；大肠部分(右肠并去，结肠用了微粒体制备)。集中八只以肠的相同部分,每段用冰冷的溶液(冰盐水加:破基丁二阱ImM)清洗.纵向切开各部分肠.洗去排泄物,放比:冰冷溶液(8nMKH2PO4,5.6mMNa2HPd1.5mMKCI.96nMNaCI.27nMsdiuncitrate,and0.04mgn1.PhCnyImeIhy1.SU1.f<>ny1.f1.uoride(PMSFU中JU溶液A清洗两次,将刮出的粘媵细胞放进溶液B(SmMKH>P(h.5.6mMNa：HPo41.5mMEDA.and0.5mMdi(hio<hreito1.and0.04mg/m1.PMSF)中，收集细眼，在90%转速热心5分钟，H1.I2a1.均匀的镀冲液洗两次(PH7.4nMKH=PO11250mM蔗糖，InWEDTA,0.(MagZin1.PMSF)将细胞重新悬浮于2m1.上述缓冲液中,用电动匀浆机使均匀化，经15<nin低速熟心(15,000g,4C),上清液用巴氏吸管吸走，脂肪层和碎片弃去，微粒体再羟高迷离心(6Omin,4C,90.000g.>将所得他粒体：&浮于25OmV葩糖溶液中,分装干微St国心管中.一80C下保存各用.肝微粒体制备：切除麻醉成年推性Sprague-DtIw1.ey大取新鲜肝脏放干冰冷盐溶液中，称盅,切碎，在冰冷辍冲溶液(5OmMPH7.4磷酸钾缓冲液，25OaM蔗糖，ImMEDTA)中用电动匀浆机搅匀,离心(77,000,15min,4,CX收集上清液,离心(18,50<,15miu.4七)弃去沉淀,上消液再离心Ih(85,600g,4匕)，产生微粒体.将所得微粒体处浮于25O11A!蔗糖溶液中，分装于小瓶中(0.5三1.瓶),一80匕下保存备用.以小牛血清蛋臼作为标准JIJBioRad分析方法检测蛋白浓度.用微粒体枪测UDP-葡萄特酸酸转移醯活性:步骤如下:(1>微粒体混合物(最终浓度大约OQSmg蛋白质/m1.),MgCI2(0.88mM).前轴二酸单内循<4.4mM)i丙甲素(0.022mg,m1.):含不同浓度底物的5()mM磷酸伸缓冲液(PH7.4)：最后加入3.5mM乐忒二磷酸葡筠糖醛酸混合物在37C孵化1030min;(3)加入170U1.溶液(乙睛:冰除酸=91:6,其中含作为内标物的100w华丸明)终止反应。(5)象计算与处理CaCo2细胞模型表观通透系数Papp=AQ(tCo)AQ为At内的转运以，A为股面积,(：为初始给药浓度啜也良好的药物的表现海透系数PaPP>1.(6cm.s:吸收为1.%700%的药物表观渗透系数PaPP.1.×!0*-1.×10*cm.s*而吸收差的药物(即吸收v%)的PaPPV1.O-7cm.S1.大H场灌注模型中黄IW类物幅的吸收公式如下：Mq=Qr(CAIa-CAixi1.)Q：液速(m1.min>:匕取样间隔时间30minsCAh.CAOU,为进11笆和出11管中计元的浓度：通过小肠排漫中的盘计算公式如下：M即=QtCMECM1,1<为肠腔出口代谢物浓度通过胆汁排泄的变化盘：MbiteSVCMbiieCM1.1.1.fc为胆汁中代谢物的浓度：V为拇JOmin收集的胆汁体枳:吸收仃分比和代谢百分比以下式计算：M41,吸收百分比二M(<aMJU1.代谢百分比二-MW是30mm内滞注的药物总量用方差分析或t检验来处理数据P-0.0511Kp<0.05*关键技术，(I)HP1.C.1.C-MS,1.CTS-MS分析技术(2)ADME/Tux系统研究4 .本项目的特色与创新之处(1)从中药活件成分吸收的角度阐述中药炮制机理。(2)应用了ADMI-ZTox系统研究黄丽单体成分EpimedinA、EpiaedinB、EpimedinC、Icariin.BaohusideI的吸收、代谢机理与动力学及淫羊精炮制品标准提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用.5 .年度研究计划及预期研究结果*研究计划(1)2006年1月2006年3月淫羊就药材的品种与鉴定及炮制品制备2006年4月2006年6月淫羊紫炮制品EPiBedinA,EpiaedinB、EpimedinC、ICariin、BaohusidcI的含量变化，并用1.C-MSJf-MSTS等分析手段对标准提取物中其他成分进行峥MI属(3)2006年7月2006年9月单体EpimedinA的吸收、代谢机理及HP1.Cx1.C-AIS分析其代谢产物(4)2006年10n-2006年12月单体EpiaedinB的吸收、代谢机理研究及HP1.C1.C-MS分析其代谢产物¢5)2007年1月2007年3月单体EpiwdinC的吸收、代谢机理研咒及IIP1.C41.CMS分析其代谢产物(6)2007年1月2007年6月单体Icariin的吸收、代谢机理研究及HP1.C、1.C-MS分析其代谢产物(7)2007年7月2007年9月单体BaohusideI的吸收、代谢机理研究及HP1.C、1.e-MS分析其代谢产物(8)2007年10月20O8年9月淫羊流生品与羊毛脂炙品标准提取物中EpimedinA,EpimedinB、EpimcdinC、Icariin、Baohuside吸收代谢机理研究(9)2008年10月2008年12月研完资料的汇总、整理等工作，进行评估和技术鉴定.*项目研究预期成果及效益(1)从中药活性成分吸收的角度阐明炮制的机理(2)在国内中文核心期刊上发表论文2篇以上，在SCI源学术期刊上录用2篇或以上。(3)完成淫羊荒药材与炮制品的HP1.C及1.C-MS分析：中药淫羊物中单体活性成分的吸收和代谢机理；利用A1.)ME/Tox系统阐明淫羊指炮制品中5个黄融活性成分的吸收代谢机理及其相互作用,提交一套完整的研究资料.(二)研究基础与工作条件1.工作基础(1)浮羊精药材质加控制药材中水份的测定取供试品25g,平铺干t：修至恒正的扁形称现中，厚度不超过5伽，疏松供试品不超过IOn.精密称定,打开瓶蛊在100105C干燥5小时,将瓶盅盅好,移置干燥器中,冷却30分忡，精密称定重;1.可在上述温度干燥1小时,冷却，称屐,至连续两次称J的差异不超过5m为止。根据减失的重见,计算.供试品中含水好<%>.表1药材水份含及测定结果样品号未干燥样品曳Ji1.（g）干燥后样品减失乘1强）含水量（%12药材中总黄阴含量的测定对照品溶液的制备：取淫羊荒计对照品，加甲髀制成饵Im1.含1.g的溶液，作为对照品溶液.供试M溶液的制备：精密信取淫羊流件测定项下供试办溶液05mI,置50m1.送瓶中.加甲静至刻度，插匀，作为供成品溶液，测定法：分别取供试品溶液和对照品溶液.以试剂为空白,照分光光度法（附录VA）.在27Om1.波匕处测定吸收度,计算，即得.表2药材中总黄阴含量的测定样品号总黄阴含量（平均值（%）123药材中淫羊素件含量的测定色谱条件:ZcrbaxC18柱（4.6*25Omm,5um>1.乙睛：水=（30：70）为流动相；检测波长为270nm:流速：1.Om1.min.标准品制i:称取淫羊菰计标准品适出，用甲醇配制成0.1.mgm1.的标准品溶液。样品制符：精率称取注羊靠炮制品约0.2g,精密林定，于50m1.居塞锥形瓶中，精密加入稀乙醉20m1.,密寤,起声处理1小时，称定，用稀乙醉补足减失里以，摇勾，港过，取续逑液，即得，测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各IOUI,注入液相色谱.测定.表3药材中淫羊转件的含疑测定样品号淫羊指普含量（平均值（）123药材指纹图谱的建立条件：色谱柱：C18柱（4.6X150.5um）:流动相：AS.5%冰电酸溶液）.B（乙膈）：B相浓度悌度洗脱:020min（25%B）,2045min（25%35%B）：流速：1.0nWmin；检测波长:272nm；选样式:20U1.样品分析色谱图见Fig3.Fig3HP1.CchromatographsofEpimedium（2）淫羊差炮制研究酒制淫羊素的炮制研究不同辅料用量对炮制品水份的影响表4药材水份含辰测定结果样品号含水量（）10%辅料20%辅料30%辅料不同辅料用量时炮制品中总黄阳含情的影响表5不同辅料用出炮制品中总黄承含量的测定样品号总黄剂含垃（%>10%辅料20%辅料30%辅料不同辅料用量时饱制品中淫羊笊件含鼠的防响表6不同辅料用圻炮制品中滓羊指首含IftfrfJ测定样品号淫羊慈昔含址（）10%辅料20%铺料30%辅料不同炮制时间对炮制品中含水量的影响表7药材水份含疑测定结果样品号含水量（%）*不同炮制时间时炮制品中总黄Si含此的影响表8不同炮制时间炮制品中总黄酮含Ift的测定样品号总黄用含量（%*不同炮制时间对炮制品中淫羊笊件含质的影晌表9不同炮制时间炮制品中浮羊维仔含的测定样品号淫羊猫背含量（）*款炙炮制研究不同猫料用M1.时盐炙炮制品水份的影响表10药材水份含壮测定结果样品号含水量（）10%辅料20%辅料30%辅料不同辅料用量对炮制品中总黄雨含胀的影响表11不同辅料用法炮制品中总黄IW含*的测定样品号总黄阳含量（%）10%辅料20%辅料30%辅料不同辅料用量对炮制品中淫羊蕾昔含量的影响表12不同辅料用量炮制不中浮羊用量含量的测定样品号淫羊常首含最（%）10%辅料20%辅料30%辅料不同炮刎时间对炮制品中含水小的影响表13药材水份含量测定结果样品号含水埴（）*«*不同炮制时间对炮制品中总黄阳含量的影响表11不同炮制时间炮制品中总黄IW含1d的测定样品号总黄阳含量（%）不同炮制时间对炮制品中注羊笊计含法的影响表15不同炮制时间炮制品中淫羊班昔含M的测定样品号淫羊菜昔含量（）*羊脂炙炮制实验研究不同用量对炮制品水份的影响发16药材水份含fit测定结果样品号含水量（%）10%辅料20%辅料30%辅料不同用出对炮制品中总黄酮含成的影响表17不同辅料用盘炮制品中总黄阴含量的测定样品号总黄剂含技%1。%辅料20%辅料30%幼料不同用员对炮制品中淫羊董件含JI1.的影响表18不同辅料用柄炮制品中淫羊猿音含ft的测定样品号淫羊就音含量()10%辅料20%辅料30%辅料不同炮制时间对炮制品中含水量的影响表19药材水份含量测定结果样品号含水埴(%)*«不同炮制时间时炮制品中总黄雨含依的影响表20不同炮制时间炮制品中总黄阴含量的测定样品号总黄剂含国<%>*不同炮制时间对炮制品中淫羊龄普含贷的影晌-21不同炮制时间炮制品中淫羊素甘含瘠的测定样品号淫羊指背含量()*由上述实验结果可以看出，涅羊米经过炮制J后其总黄酎含出和涅羊希昔含Ift都有不同程度的下降.临床上常以羊油炙淫羊笊入药.经实验表明羊油炙淫羊辕巾总黄胴含属以及淫羊范背含量较其他饱制M种的黄制和淫羊董件含此高.<3)淫羊流苻在体肠潮流研究申谕人已经就涅羊素中活性成分之涅羊希A=的吸收和代谢作了初步实验，精密称取淫羊指音加入Kreb-RinjIerS溶液定容,制成时照品溶液，精密收取淫羊也昔对照品液IOni】(用含的红20Ug/m1.KrebRingers溶液定容.作为潴注液，漱注实验中每岁小时收集份样品。而潴注液以及接收液进行紫外测定其中由于水份吸收引起的酣红浓度的变化，另外对灌注液和接收液用液相检测其中成分的变化，实骁结果衣明悭羊希甘在大鼠体内很快被吸收，井产生相应的代谢产物(Fig7中保留时间为2min和21min的成分)F4UP1.CchromatographsofIcuriinFig5HP1.CChronuitographsofb1.ankrfusedso1.utionFig6HPI.Cchromatographsofperfusedso1.utionFig7HP1.Cchromatographsofeff1.uxso1.ution<4>植物药成分比较复杂，吸收代谢的研究报道较少，中请人在美国访问期间研究了植物药RedC1.over标准提取物的吸收与代谢.方法可行RedC1.over标掂提取物的HP1.C分析图谱见FigDFig8HP1.CchromatographsofRedC1.over(fo11nonone<inandbiexrhaninA)andtheirPhase11metabo1.ites.Compoundswere1.abe1.edasinterna1.standard(IS,testosterone,46.1min),fomonone(in-Morfrmononetin-7)-O-g1.ucuronicacid(13.0min),biochaniAM2orbiochaninA-5-0-g1.ucuronicacid(14.3min),biochaninA-M1.orbiochaninA-7-O-g1.ucuronicacid(22.1min),daidzein(23.8min),gcnistcin(32.2min),formononctin(40.5min),andbiochaninA(51.5min).Pane1.AshowstheHP1.Cchromatogramsofaperfusateso1.u1.ionbeforeitenterstheperfusedsegment(so1.id)orafteritexits(hePerftISedsegment(dashed1.ine),Pane1.Bshows<heHP1.Cchromatogramsofadi1.utedbi1.ebefore(dashed1.ine)orafter(so1.id1.ine)treatmentofg1.ucuronidascs+su1.fatascs.Pane1.Cshowschromatogramsofamicrosoma1.reactionmixbefore(so1.id1.ine)orai1.cr(dashed1.ine)g1.ucuronidationrcac(ion.TheHP1.CconditionisspecifiedinthefctMateriaIsandMethods.0