花生疮痂病菌毒素对寄主细胞的毒性及其生理生化机制研究.docx

花生疮痂病菌毒素对寄主细胞的毒性及其生理生化机制研究研究内容和意义花生疮痂病(Sphace1.omaarachidis)是我国花生产业中最重要的病害之%痂囊腔菌毒;素(E1.SinOChrOmC)是E1.SinOC类真菌产生的一种具有光检性的龙鼠类植物毒素，在病菌侵染寄主植物过程中起到重要作用的俸力因子。植物病原菌的毒力因子及其机制研究是揭示了病原菌与植物相互识别、协同进化和致病机制的重要研究内容。由F花生疮痴病近年来爆发成灾，研究历史较短，研究基础相对薄弱，病菌的致病因子、致病机制、毒素对寄主细胞的毒性、在致病过程中的作用及机制尚不明确，无法诠释病菌与寄主之间的互作机理。本项目以花生疮痂病菌为研究对象，在前期研究的基础上，以细胞悬浮体系为试验平台，利用植物病理学和病生理学理论和研究方法，对花生疮痴病菌毒素的细胞毒性，脂质过氧化、细胞膜损伤和病斑扩展动态的作用及其机理进行系统研究,分析OT和比。2等活性氧在细胞程序性死亡过程中的作用机理，探索淬灭剂对细胞凋亡和病斑扩展动态的抑制作用，旨在明确花生疮痂病菌毒素在致病过程中的作用及其生理生化机制，研究结果对于揭示花生疮痂病菌的寄主-病菌互作和致病机制，抗病育种及新型防控药剂和技术的研发奠定了理论基珈。关健词：花生疮掘病：痂囊腔菌毒素：致病机制：细胞毒性已取得成果(1)完成J'花生疮痴病菌病原学和分子特性研究。课题组前期对辽宁省阜新、葫芦岛和锦州及河北、山东、江苏和广西等主要产区进行了病害调查和病菌分离鉴定，分离得到菌株400余株，并建立了稀释研磨快速扩繁体系：完成了代表性菌株的生物学和分子特性研究。(2)完成了辽宁主栽花生品种的抗病性鉴定、病害流行及接种条件研究，筛选出白沙1016为高感品种(周如军，2013；2014),明确了花生疮痂痫菌的接种条件,(周如军，2017)为本项目的致病性测定研究内容提供了试脸材料和技术方法.(3)建立了花生疮痂痛菌毒素的分离和提取条件：将烘干的菌饼巴于丙酮中连续两次萃取16h后合并，溶液经旋转蒸发挥去丙酮后，将瓶壁用Im1.丙酮溶解得到花生痂囊腔菌奇素提取液，用薄层色谱法进行鉴定.(4)建立了白沙1016的细胞悬浮体系：课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立细胞悬浮体系。愈伤诱导：MS添加1.5mg1.24D1.Omg1.KT+3.0mg,1.6-BA:悬浮培养：MS液体添加2.5mg1.2.4-D+1.5mg'1.KT+2.5g1.6BA+30g1.谶糖”颈期成果本项目以花生疮痂病菌为研究对象在前期研究的基础上,以细胞悬浮体系为试验平台，利用植物病理学和病生理学理论和研究方法，对花生疮痴病的律素的细胞毒性，脂质过氧化、氧化胁迫和淬灭剂的作用及其机理进行系统研究，旨在明确花生疮痴病菌毒素在致病过程中的作用及其生理生化机制，研究结果对于揭示花生疮摭病菌的寄主-病的互作和致病机制，抗病育种及新型防控药剂和技术的研发契定了理论基础。<1）建立一套技术成熟的花生细胞悬浮体系，为花生病害的致病机制研窕提供技术平台。（2）明幽花生疮摭病菌惟素在致病过程中的作用及其细胞毒性：（3）明确花生疮痂病菌毒素细胞毒性的生理生化机制，为病菌的致病机制研究和抗病育种提供理论依据：（4）明确活性氧淬灭剂对细胞港性和病情扩展动态的抑制作用机制，为花生疮痂病新里防控药剂和技术的研发奠定理论机制.（5）发表研究论文2-3篇,其中Sa论文1篇，培养研究生2-3人申请者学历和令加科研工作简历周如军，博士，副教授，硕士生导师，主要从事植物真菌病害及病害流行学教学和研究工作。现任辽宁省植物保护学会副秘书长和植物病理教研室副主任。先后获沈阳农业大学优秀指导教师、吉年骨干教师和十佳青年教学科研岗位能手等称号。2014年入选辽宁省农业领域吉年科技创新人才培养计划。主持辽宁省博士启动基金“花生疮痂病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）工辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划花生疮痂病侵染机制及其流行成灾关键因子研究（2014（）56）”和校者年教册基金等5项，作为第执行人参加国家自然基金、农业部公益性行业科研专项、科技支撑计划、辽宁省自然基金和辽宁省农业攻关项目等7项。在PkIntDiSease、Phytoparasitica>Myco1.ogica1.Progress,植物病理学报久中国油料作物学报和植物保护学报等国内外学术期刊发表论文30余篇，其中SCI收录12篇。主编著作I部，副主编图说花生病虫害防治关键技术等著作4部。获辽宁省政府科技进步三等奖3项，市厅级科技进步等奖2项,辽宁省教学成果三等奖1项,全国多媒体课件大赛一等奖2项.申请者发表或参与的主要论着目次和获奖情况近三年，申请人以第作齐或通讯作者在中国农业科学、中国油料作物学报hP1.antDisease.EuropeanJourna1.ofP1.antPatho1.ogy和Myco1.ogica1.Progress等国内外学术期刊发表论文“花生疮掘病曲侵染条件及寄主抗性响应”、“花生褐斑病菌和网斑病菌混合侵染对侵染概率和潜育期的影响”、“辽宁花生品种对疮痂病抗性及流行时间动态分析"和"CharaaerizmionofSdemtinianiva1.iscausingSc1.erotiniarotofPu1.sati1.1.akoreanainChina/,等18篇，其中SCI收录IO篇（具体目次见佐证材料）。参与课即组发表论文50余篇。2016年主编药用植物病害原色图鉴B（中国农业出版社）1部，副主编图说花生病虫害防治关键技术（中国农业出版社）。2015先获辽宁省政府科技进步三等奖1项，2OI52O16获辽宁省自然科学学术成果学术论文二等奖2项。申请者己完成或正在承担（负责或叁加）省级以上（含省级）各类科研计划、基金资助项目情况（包括：项目名称、编号、来源、起止年月、进展等）（限制字数：500字）（1）主持辽宁省博士启动基金项目“花生疮痂病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）”,2013-2015,已于2015年圆满完成任务结题工作。（2）主持辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮痂病侵染机制及其流行成灾关键因子研究（2014056）”项目,2014-2016.己基本完成项目研究内容，正撰写论文及项目结题材料，等待结题验收。（3）参加人参病虫害灾变规律及安全防控技术集成研究，农业部公益性行业科研专项病害专题（201303111）,2013-2017,项目进展顺利.（4）参加国家自然科学基金面上项目（31171791）,双株定向栽培模式对玉米纹枯病流行影响及灾变机制研究，2012-2015,已于2015年留满完成任芬结题工作。（5）参加五味子主要病害无公宙防治技术体系研究（2（X）6BAKWB（M-W）,国家“十一五”科技支掾计划项目专题，2006-2009,已于2010年例满完成任务结题工作。（IX项目提出背景（【提示】相知域国内外发展现状与趋势：我省现有技术基础；立题必要性；项目申报单位实施该项目的优势.限制字数：500字）花生疮痂病（SPhaWaMid2近年来在我国主要花生产区流行成灾，分布广，危害重.且有逐渐向北磋延的趋势，已成为我国花生产业持续发展中亟待解决的植保问题。植物病原南的毒力因子及其机制研究是揭示了病原菌与植物相互识别、协同进化和致病机制的重要研究内容，对于揭示病原菌的寄主-病菌互作机制、抗病育种，新型防控药剂和技术的研发具有重要研究意义。2011年始花生疮痂病在我省阜新、葫芦岛和锦州等主要花生产区爆发成灾，严重影响我省花生产业的健康发展，但由于该病害的研究历史较短，国内外研究基础相对薄弱，病菌的致病因子、致病机制、毒素对寄主细胞的毒性、在致病过程中的作用及机制尚不明谶，无法为该病害的致病机制研究和新型防控技术的建立提供技术支持。申请人所在团队前期对该病害的发生怙况、病原学、发生规律、流行动态和防控技术进行了系统的研究报道，同时开展了花生疮疵病菌毒素的分离和提取条件、细胞悬浮体系优化等研究，主持花生病害科研项目3项，发表多篇相关学术论文，出版G图说花生病虫害防治关键技术著作，具有扎实的研究基础和优良的研尢团队，为本项目的顺利实施提供了保障。科学水平及意义植物病原菌的致病因子和机制研究揭示r病原菌与植物相互识别、相互作用中协同进化的关系，对于抗病育种研尢，新型安全防控技术的开发具有重要意义。然而，花生疮痂病为近年来新流行病名,在其毒素产生机制、毒素对寄主的毒害、在致病过程中的作用及机制上不明确，研究基础薄弱，无法诠释病曲与寄主之间的互作机制。本项目以花生疮揄病菌为研究对象，在前期研究的基础上，以细胞悬浮体系为忒验平台，利用植物病理学和病生理学理论和研究方法，对花生疮痴病菌毒素的细胞毒性，脂质过辄化、细胞膜损伤和病斑扩展动态的作用及其机理进行系统研究，分析OT和HQ2等活性氧在细胞程序性死亡过程中的作用机理，探索淬灭剂对细胞凋亡和病斑扩展动态的抑制作用,旨在明确花生疮痂病菌毒素在致病过程中的作用及其生理生化机制，研究结果对于揭示花生疮痴病菌的寄主病菌比作和致病机制，抗病育种及新型防控药剂和技术的研发奠定了理论基础。（3）、项目主要内容与指标【提示】主要研发内容；拟解决技术关陡点及主要指标.限制字91.500字）主要研究内容：（1）花生疮痂病菌毒素对寄主细胞的毒性研尢：利用花生细胞悬浮培养体系和致病性测定,明确花生疮痂病菌毒素含量与细胞死亡率和病斑扩展动态之间的关系.确定花生疮痴病菌毒素在致病过程中的重要作用。（2）花生疮痂病菌毒素在寄主-病菌互作过程中的作用机制研究：通过SOD、PPO、CAT等寄主防御的的响应动态，寄主细胞膜的选择透过性、流动性、细胞膜的活性和腹膜过氧化程度,活性氧的种类及含星测定，明确花生疮痂病菌毒素对寄主防御的、质膜过氧化和氧化胁迫的作用机制（3）淬灭剂对细胞毒性的缓解作用及其机制研究，进一步证实毒素是花生疮痂病菌的垂要致病因子。拟解决技术关键点及主要指标：（I）花生疮狮病菌毒素对寄主细胞的毒性及其机制：从细胞程序性死亡、抗性的响应、细胞膜损伤和活性氧等方面揭示菌毒素是花生疮痂病菌的重要致病因子。（2毒素诱导产生的活性氧是寄主细胞程序性死亡的关键机制：活性氧的含量与细胞程序性死亡的关系及淬灭剂对细胞毒性的抑制作用正反两个方面证明活性氧的重要作用。（4）、项目主要创新点【提示】主要创新点，以及覆期获得的研究成果倚况.限制字数：500字）（1）首次揭示花生疮痂病菌毒素为病菌的重要毒力因子，为花生疮痂病的致病机制的研究提供理论基础。（2）利用细胞悬浮培养技术从细胞膜和活性氧两个方向研究花生疮痂病菌毒素对寄主植物细胞的损伤及其诱导细胞程序性死亡过程，能够更加准确地阐述其作用机制.（3）通过添加活性氧淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒宙作用，不仅能够反向证明港素是花生疮加病菌的重要致病因7.而且研究结果能够为花生疮痂病的踪介防治提供一个崭新的视角。（5X项目实麓的可行性（【提示】项目拟采取的研究方法（成技术路线、实法方案的可行性前况.限制字数：500字）项目申请人所在团队长期从事花生病杏研究工作，具有扎实的研究基础。申谙人近5年来先后主持参加了辽宁省科技攻关项目“花生病虫害安全控制技术体系研究（2011214（X）2）”、辽宁省博上启动基金项目“花生疮痂病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮痂的侵染机制及其流行成灾关键因子研究2014056）”等多个相关研究课题，对花生疮痴病的分离培养技术、生物学特性、致病性、发生规律等方面进行了系统研究，发表多篇论文，相应研究基础扎实。课题组近年来开展了花生疮痂病菌不同菌株产毒能力、致病性差异和产毒条件等研究工作，为本项目的顺利实施奠定J'很好的前期研究基础.，本项目在对病原菌与植物互作机制研究过程中，采用病原菌的次生代谢产物毒素作为研究对软，以细胞悬浮体系作为基础，从细胞水平深入探讨毒素的作用机制，通过测定内二醛含量及细胞膜透性明确毒素对细胞的毒害作用，在此基础上，通过薄层色谱发分析活性毓，明确活性氧在毒素致病过程中所扮演的i1.1.要角色，进而系统的说明毒素是花生疮痂病菌致病的毒力因子。（6）、项目预期目标与效果前景分析（【提示】项目预期目标与效果（包括经济、社会、环境等）分析筒况.限制字数：500字）（1）项目研究过程中花生细胞悬浮体系的建立和优化不仅仅对本项目的研究提供了便捷试验材料和条件，同时对丁其他花生病害致病机制研究工作以及如花生品种资源保存、遗传转化和功能基因插入突变等等相关研究工作提供了技术平台，并且通过细胞悬浮体系，从细胞膜损伤和氧化胁迫两个角度对花生疮痂病菌毒素在致病过程中的生理生化作用机制进行了深入研究，该研究结果对于花生疮痂病菌致病性后续研究深入研究工作提供了理论研究基础（2）本项目画立了花生疮摭病菌毒素的提取条件，为研究病原菌与植物瓦作提供充足的研究材料，为理解病原菌在致病过程中毒素作为致病因子的重要作用奠定基础.（3）本项R中通过添加活性氧淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用,不仅能够反向证明毒素是花生疮痂病菌的重要致病因了，而且研究结果能够为花生疮痂病的综合防治和新型安全药剂的创制提供一个崭新的视角。（IX项目组主要成员研究能力与分工构成情况，以及正在承担（负责或参加）的省级以上（含省SD各类计划、基金资助项目情况，限制字数I500字）周如军（负贡项目全面实施工作），博士，副教授，硕士生导师，主要从事植物真菌病杏及病害流行学教学和研究工作。2014年入选辽宁省农业领域百年科技创新人才培养计划。先后主持科研项目5项，作为第执行人参加国家自然基金、农业部公益性行业科研专项、科技支掾计划、辽宁省自然基金和辽宁省农业攻关项目等7项。第一作者或通讯作者发表学术论文30余篇，其中SC1.收录12篇0主编著作I部，副主编4部.获辽宁省政府科技进步三等奖3项，市厅级科技进步一等奖2项，辽宁省教学成果三等奖1项。傅俊范（负货病原学研究工作），博士，教授，博士生导师。现任植物保护学院党党委书记，兼植物保护一级博士点学科带头人，辽宁省植物保护一级重点学科带头人、辽宁省专业技术二级岗位教授、享受国务院政府特殊津贴专家等荣誉称号。先后主持国家自然基金等20余项科研项目。曾获辽宁省科技进步二等奖3项、三等奖4项。发表学术论文2（X）多篇.项目组其他骨干成员：薛彩云，讲师，负责致病力研究：研究生5人（焦文莉，赵杰锋，刘膈，李元杰，徐梦雪）参与本项目致病机制研究工作。（2X承担单位现有研究仪叁、设备情况，以及借助省级以上（含省SD重点实验室开展本项目研究的情况I限制字数：500字）课题组所在的植物病害流行研究室依托辽宁省及农业部Ig点学科植物病理学科及辽宁省植物病击Jg点实验室，技术力量较强，设备条件先进，近年来伴随着沈阳农业大学的跨越式发展，在省、市和学校的大力支持卜.，投入大量经费进行先进设备仪器添置和更新换代，建立了学院和学科中心实验平台,结合学校开放科研平台.现拥有分子生物学、植物生理学、植物病理学、生物化学等相关学科完整、先进的实验设备和仪器平台，能够满足本项目研究所需要的实验仪器好软硬件条件。（3）、前期相关工作进展、以及研究时间及其他相关保证条件（限制字数：500字）近年来，课题组在完成花生疮加病菌病原学、侵染过程、流行动态和防控技术的基础上，相继开展/与本项目相关的致病性测定、接种条件、分子特性、毒素的提取和细胞悬浮体系研究工作，具体如下：（1） 2O1O2O13年完成了花生疮痂病的病情调杳、发生.规律和防控技术研究工作：（2） 2014-2015年完成J'花生疮痂病的病原菌分离鉴定、病原学、田间流行动态、抗病性鉴定工作，分齿菌株400余株，筛选出抗感品种类群，完成病菌ITS、TUB、1.SU等测序工作，为本项目研究的病菌和植物试材及技术方法提供了保证。（3） 2016年主要开展了花生疮痂病菌毒素提取方法和花生细胞悬浮体系的研窕工作，现已初步建立并优化了上述两个体系，为本项目研究的峡利实施提供了技术平台。课题组拥有扎实的研究基础，并具备固定研究人员3人（高级职称2人，中级职称1人）和从事花生病害研究工作研究生5人,知识结构和年龄结构合理,能够保障该项目的顺利实施。项目覆期进度安排（【提示】注明覆期实籁进度安排的初步计划（即阶段性工作要点）,限IW字段：100O字）2017年3月42月，花生疮痂病菌大量扩繁培养，利用已建立的提取方法对花生疮痴病菌毒素进行提取、分离纯化：继续优化花生细胞悬浮体系，建立稳定平齐的花生细胞组织；利用花生疮痴病菌毒素对花生进行接种，明确其在侵染过程中对病班扩展的影响：通过添加一定浓度的毒素，测定花生愈伤组织中相关防御施活性，如超氧化物歧化醵、过氧化物前及抗坏血酸氧化酶等，明确花生痴囊腔菌毒素在植物发病过程中生理生化等动态变化，进而为花生痂囊腔菌毒素致病机制的更深一步研究做好研究基础.2018年1月.2018年12月：提取花生疮揄病菌毒素并优化花生疮痂病菌毒素的提取条件，通过添加不同浓度的毒素.测定花生细胞悬浮体系中细胞死亡率，细胞膜透性及丙二醛含量等相关指标，明确花生痂囊腔曲毒素对细胞损伤及其使细胞膜过氧化的机制，探索其诱导细胞程序性死亡的的机制。参加国内外学术会议1次。发表学术论文1-2篇。2019年I月-2020年4月：花生疮旃病菌毒素对活性料产生动态研究：通过添加不同浓度的毒素，测定组织及细胞内活性氧的产生及含量，探索活性氧在细胞凋亡过程中的作用机制：通过添加能使活性氧失活的淬灭剂、活性氧清除剂等试剂，明确淬灭剂对细胞损伤以及花生疮痂病的抑制作用，进一步证明活性氧的重要作用，整理研究结果，撰写结题报告，撰写研究论文12篇。