花生疮痂病菌侵染对寄主防御酶活性的影响 654061668.docx

花生疮痂病菌侵染对寄主防御酶活性的影响摘要：本文对花生受疮痂病菌侵染后,寄主体内相关防御解系活性的变化进行了研究.目的是进一步认识PA1.（笨丙纪酸解依醉）、PPO（多酚氧化醉）、PoD（过氧化物的）、CAT（过就化乳筋）和SoD（超氧化物歧化府等解与花生疮榭病抗性的关系及特性,结果表明接种疮痴病菌后不同抗病性花生M种体内的防御的活性普遍升高，本试验研究冽定联系在.24-72h内均有G大俏出现，但抗衲品种一般比感病品种防御的活性开高快，且配活性峰值饯离于感病品种。关健词：花生疮揄病：病菌侵染：抗病性：击主防御前前言辽宁花生因品质优良，色泽鲜艳、美味可口、不含黄曲轴毒素等特点，在国际市场上享有更高的声誉。近年来，随着花生.经济效益的不断提高和农业产业结构的调整，花生种植面积逐渐增大，截止2012年仅辽宁省种植面积已突破40万hm?（600万亩），继玉米和水稻之后成为第：大主栽作物（周如军，2013）.随着种植面积的不断增大，花生病需问题逐渐凸显，尤其以花生疮痂病增幅最大，自20H年在辽宁阜新、锦州和葫芦岛等主要产区爆发流行以来，每年都给花生产量造成严重损失，该病害目前已经成为生产上主要病害之一.然而，由于花生疮揄病是近年来新流行病害，对于花生疮痂病的研究国内外主要集中在发生调查、病原学（根岸宽山，1979：蔡学清,2000）.化学防治（方树民,2006）和抗性鉴定（方树民，2（X）7：周如军，2014）等领域，郭陞j<2015）研究病害发生后植株内部生理变化，尚无关于病菌侵染过程中植株的生理特性变化的报道。为此，我们开展从生理生化水平探讨在病菌侵染过程中品种对花生疮痂病抗性机制的研究，目的是为科学利用品种抗性控制花生疮痂病严全危害提供理论依据，使花生生产达到高产、安全、冬染色，保障辽宁花生产业的健康发展。1材料与方法1.1 供试品种与三株供试花生品种：感疮痂病品种白沙1016和抗疮碗病品种阜花17,均由沈阳农业大学植病流行研究室提供.供试菌株：花生疮痂病菌从采自阜新地区的病株分离获得，经纯化、在PDA培养基上培养30d后，用手术刀取卜.菌落，移入研林中，加入无菌水充分研磨制成菌丝研磨液。将菌丝悬浮液浓度调至在6（X）nm波长下的吸光度（OD480）为2.0,加入少量淀粉（1%）以增加菌悬液与植株的粘附性和菌丝的活性，作为接种备用。1.2 供试花生植株培育及接狎处理在直径为15Cm的花盆内播种供试花生种子，每盆3株，在花生开花下针期喷雾法接种疮痴病菌菌丝悬浮液，以无菌水为空白对照，重发3次。接种后0、12、24、36、48、60、12、84、96、108、120、132、144h分别采集相同部位（第35分枝）的叶片，-80C保存备用.IJ病情调查统计和分析每处理随机抽样20株,接种30d后统计每株叶片数和各级病叶数.计算病叶率及病情指数“花生疮痴病分级标准参照方树民等分级标准见表1.3»但£（各皱病枝数X代表值）病情指数二.3X100调食总枝数X最局病级代表值表1花生疮痴病分级标准Tab1.c1.Thestandardofdiseaseratingofpeanutscab的级Ratingofdisease代表也Va1.ue分级标戕Sutikhrdofdiseasefing00金楂无嵇II分枝上有少数病期,叶片能正常展开I1.2分枝上病斑较多.叶片明显皱油：或某茎节鸨我连成釜状III3新抽出叶片燃右,病斑占叶面积Ia左右；或有两个茎节密布愈合IV4新桁懒叶崎形卷皱.叶柄扭曲.病理占叶加积】，2左右：或行3个茎节病JM密布愈合V5分枝明显施化,顶叶枯死或叶维枯焦,SJ分叶片脱落I或多数茎节病嫌呈木栓化粗生意介V1.6分校枯死1.4寄主抗病相关HI的提取及活性浦定1.4.1 奉丙氮酸解氮事的能定苯丙氨酸解氨酶的测定参照余叔文，汤章城的测定方法，取样品0.5克，放入预冷的研钵中，加入5m1.O.05MpH«.8硼酸级冲液（内含5mM然基乙醇，ImMEDTA和1%PVP）和少量石英砂，冰浴研磨成匀浆.于4C在15000rmin下离心20min,上清液即粗上液,定容至IOm1,冰箱保存备用.测定时取甲、乙两支试管，分别加入OJM硼酸缓冲液3.8m1.,0.02M定肘丙氨酸Im1.甲试管加入0.2m1.前液，乙试管以0.2m1.硼酸缓冲液作为对照.于409水浴60min,立即加入Im1.盐酸终止反应。随后测定OD290值，以OD值变化0.01为一个的活性单位。PA1.活性（0.01g1min'）="与：100×t凡XP1.t：反应时间(min),VT：样液总体枳(m1.),VI：测定时样品用量(m1.),Fw：样品鲜重(g)1.4.2 多酚化第的测定多酚氧化施的测定参照余叔文，汤堂城的方法，略加修改。取样品Ig加入预冷的研钵中，加入5m1.0.05M预冷的pH6.8磷酸缓冲液和O.1.gPVP及少量石英砂，冰浴研磨成匀浆。于4C在1.5000rmin下离心20min,上清液即粗酣液,定容至25m,置于-20C冰箱保存备用。测定时取甲、乙两支试管，分别力I1.入0.02M邻苯二酚1.5m1.,().()5MpH6.8磷酸盐缓冲液1.5m1.甲试管中加0.1m1.酶液,乙试管对照不加解液，以OJmI磷酸缓冲液代咨，30C水浴2min,398nm处测OD值。OD,9×K×1000PPO活性(0.01g,s*)=-Fw×V×tU反应时间(三),VT：样液总体积(m1.),VI：测定时样品用址(m1.),Fv：样品鲜至(g)1.4.3 过氧化物B1.的测定过氧化物施的测定参照余叔文，汤章城的方法，取样品Ig加入预冷的研钵中，加入5m1.0.05M预冷的pH6.8瞬酸缓冲液和O.1.gPVP及少量石英砂，冰浴研磨成匀浆。于4C在15000rmin下离心20min,上清液即粗酶液,定容至25m1.,ST-20T冰箱保存备用。测定时取甲、乙两支试管，分别加入005MPH6.8磷酸林缓冲液ImI,1%愈疮木酚ImI和粗酹液1m1.,摇匀后置30C恒温水浴中5min。平衡后向甲试管加入0.1%H2021.m1.,乙试管加入蒸饱水1m1.,摇匀，立即以秒表计时，约Imin后将反应液倒入比色杯，以乙试管作为校零对照，在第2min时于47Onm处测定甲试管中OD值。POD活性(0.01-g-'.min-1)=Fw×V×tt：反应时间(min),VT：样液总体积(m1.),VI：测定时样品用量(m1.),Fw：样品鲜或(g)1.4.4 过氧化氢胸(CAT)、超氧化物歧化醇(SoD)的测定陂液的提取：准确称取0.5g样品按歪量(g):体积(m1.)=1.9的比例加入4倍体积的生理盐水(CAT),重量(g>:体积(m1.)=1.U的比例加入4倍体积O.1.mo1./1.pH7.0的磷酸缓冲液(SOD)于研钵中，置于冰浴条件下研磨至1.()%(Ctr),20%(SOD)的匀浆液后再转移到I。m1.离心管，混合均匀后于4匕、4(XX)r/min离心IOmin,取上清液即为酶提取液，置4C保存备用。CAT、SOD活性测定按南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒说明书介绍的方法进行测定。2结果与分析2.1病情调查结果从表2结果可以看出，阜花17病情指数较小，比较抗病，且品种鉴定和田间表现基本一致，说明这些品种的抗性遗传稳定。调杳还发现，病菌较易侵染嫩叶，尤其是分枝顶端嫩叶，白沙1016分枝顶端嫩叶发病率高达78.1%,般不侵染老叶，病菌在白沙1016上的潜育期比阜花17短1.d品种感病程度越高潜育期就越短。表2病情调查结果Tab1.e2Theresu1.tofdiseaseindexAA种幺称Vanciies分枝顶端峨叶Theabove1.crIc叶部病情指数茎部病忸指数Diseaseiikicx游窃期<d)1.aicntperiod1，U1.RepIikM1.ieiiIDi*c;iscindex发布率%Mxt>1.i1.y病情指数Di*c*ciXrx«M2RqpikMtkm2*M3RqMicMkm3平均Amgc白沙!01678.128.39.69.212.410.424.24中花171954.71.72.42.22.14.952.2病首侵染过程对花生防御募活性影响2.2.1笨丙氨酸解第ShPA1.)活性变化图1表明，在病菌侵染过程中，两个不同花生品种的叶片PA1.活性有明显升高'，在测定时间范用内，活性曲线都有一个明显峰值出现。抗性品种早花17在接种拖痂病菌24h后，PA1.达到峰值1135Ug,之后迅速下降，72h后PA1.活性基本稳定，PA1.活性与其对照相比分别升高了19.5%,28.4%,15.4%,10.8%,11.3%,8.9%,6.5%,8.0%,8.0%,8.4%,6.2%和4.9%；而感病品种白沙1016在接种病菌后PA1.活性增加缓慢，接种60h后才出现活性高峰997Ug,峰值比阜花17显著低，之后又迅速下降，PA1.活性与其对照相比分别升高/3.8%,9.7%,10.2%,5.7%,15.7%,13.6%,10.4%,4.7%,2.1%,3.4%,4.4%和2.3%。总体来看，抗病品种比感病品种升高的幅度相对较大。2c,e1.斜Iad华妲建Nd-11y>oi6c-臼沙1016TR-宰花17CK-½17TR01224364S60728496108120132144处理时向Treatmenttime（三）图I病菌侵染过程对花生叶片PAI.活性的影响Fig.1.EffectonP1.activityin1.eavesofpeanutafterinocu1.ationwithSphace1.ofniirac1.idis2.2.2多酚氧化UiPPO)活性变化图2表明，在病菌侵染过程中，花生叶片中的PPO活性变化显著。抗病品种阜花17曲活性在接种处理后I2h内增加比较缓慢,I2h后迅速提高,在36h时达到最大值IO24Ug,之后活性谖慢下降，到72h时趋于平稳，PPO活性与其对照相比分别升高了1.5%,16.5%,36.0%,21.9%,17.9%,9.4%,7.6%,7.1%,9.5%,6.1%,6.0%和8.7%：而感病品种白沙1016酶活性在60h内增幅不大,从60h开始施活性迅速升高，到72h达到最大值91.4Ug,明显不及阜花17活性最大值高，PpO活性与其对照相比分别升高了0.3%,5.3%,9.7%,103%,12.4%,23.8%,6.6%,6.4%,4.2%.5.5%,3.1%和3.7%,上升速度及活性强度均低于阜花17.Is1FS0出)EA二ZOddW1.odd-白沙06CKT-白沙1016TR毕花17CK-9t1.7TR01224364860728496108120132144处理时间Treatmenttime（三）图2病曲侵柒过程对花生叶片PPO活性的影响Fg.2EffectonPPOactivityin1.eaves>fpeanutafteri>cu1.u1.inwithSp1.uiie1.oniaarachidis2.2.3过氧化物等(PoD)活性变化图3表明,在病菌侵染过程中，花生叶片中的POD活性变化显著。抗性品种早花17接种后I2h内PoD演活性虽有升裔但并不显著，I2h后急剧增加，36h达到最大值82.1Ug,然后迅速卜.降，72h趋于稳定，POD活性与其对照相比分别升高了8.1%,22.3%.30.8%.19.9%,13.9%,10.2%,9.5%.5.7%.11.3%,6.2%,5.9%和6.3%：而感病品种白沙1016中POD活性在48h内变化不大，48h到60h之间活性剧增，之后急剧卜.降，到96h时的于平稳，PoD活性与其对照相比分别升高了7.0%,5.9%,9.5%.10.7%,22.8%.10.2%.3.7%.2.9%,3.7%,3.1%.6.2%和5.2%,PODM活性最大值与平稳后的活性均不及阜花17“75-白沙1016CK-M-白沙1016TRuu-8运)r>二。BaFE-1.p一T-辛花17CK-用花17TR012243648607284%108120132144处理时间Treatmenttime（三）图3病的侵案过程对花生叶片POD活性的影响Fig.3Effect>nPODactivityin1.eavesfpeanutafteriiHru1.ationwithSp1.utce1.omaarachidis2.2.4过氧化氢II(CAT)活性变化图4表明，在病的侵染过程中，花生叶片中的CAT活性变化显著。抗病品种早花17受病j侵染后酣活迅速提高，在24h时达到最大值9.1.2U'mgpro1.,之后活性迅速卜降，到48h时用于平检，CAT活性与其对照相比分别升高了30.4%,68.0%.38.8%,19.0%,16.7%,15.2%,16.2%,20.6%,16.6%,16.1%,16.5%和14.7%；而感病品种白沙1016的活性在48h内增幅不大，从48h开始前活性迅速升高，到60h达到最大值8.47Umgprot.之后活性迅速卜降，到84h时活性基本稳定，PA1.活性与其对照相比分别升高了7.0%,12.6%,14.0%,20.2%,47.0%,20.7%,11.2%,10.4%,10.3%,13.8%,11.0%和8.8%,到达活性高峰时间明显低于阜花17。10GoJd置/己1.>二。EB定.1.Vo-1016CK<-白沙1016TR-取花17CK-'it1.7TR01224364860728496108120132144处理时间TreaIment1.ime（三）图4衲菌侵染过程对花生叶片C活性的影响Fig.4EffectonCATactivityin1.eavesoI-peanutafterinxru1.atinwithSphtice1.oniaItrachidis2.2.5超氧化物歧化薛(SOD)活性变化图5表明，在病的侵染过程中，两个不同花生品种的叶片SOD活性有明显升高'，在测定时间范围内，活性曲线都有一个明显峰值出现。抗性品种阜花17在接种疮痂病菌24h后，SOD达到峰值452UgFW,之后迅速卜降，48h后SOD活性基本稳定，SoD活性与其对照相比分别升高了28.4%,63.2%,28.7%,9.7%,9.2%,5.6%,6.8%,3.8%,3.9%.1.6%,46%和-3.0%；而感病品种白沙1016在接种病菌后SOD活性增加缓慢，接种48后才出现活性高峰378UgFW,峰值比阜花17显著低，之后乂迅速下降.SoD活性与其对照相比分别升高了6.6%,18.1%.30.8%,45.9%,35.2%,16.0%,5.5%.2.2%,2.1%,-0.7%,-1.8%和26%.到达活性高峰时间明显低于阜花17.£Vn)>.1>二。Bos三运0。S-白沙1016CKT-白沙1016TR-卓花17CK-阜花17TR01224364860728496108120132144处理时间Treatmenttime（三）图5病第侵染过程对花生叶片SOD活性的脂响1.*'ig.5EffectonSODactivityin1.eavesofpeanutafterimu1.ationwithSphace1.omaarachidis3结论和讨论抗性鉴定试验证明花生不同品种之间对疮痂病的抗性存在差异，阜花17«抗疮痂病，而白沙1016感病严重且潜育期较阜花17短Id。目前，辽宁省花生.主栽品种为白沙106占种植面积的65%-70%,个别地区甚至全部种植该品种(周如军，2013),生产中大面积种植抗性较差的白沙1016是造成花生疮痂病在辽宁省流行成灾的重要原因。病原菌的侵入可流导植物产生一些生理活性物质，它们参与许多生理代谢过程，如氧化反应、木质化反应和对病原物毒素的反应等，防御的系在这些生理代谢中起重要的作用。本试验寄主体内主要防御酸PA1.、PPO、POD、CAT、SOD施活性变化及升高都是在接种后才发生，通常变化规律为2472h内达到活性高峰.随后快速下降，最后在较长的一段时间内持续保持比对照活性显著高的而活性期：不同抗性品种之间防御隧变化曲线、活性峰值出现快慢也不同，抗性品种阜花17酹活性峰值均要早于感病品种白沙1016。另外，同一花生品种主要防御施活性变化曲线也存在差异，不同的防御施到达的活性峰值的时间也不尽相同.抗性品种阜花17接种疮痂病菌后主要防御阱活性达到高峰的时间都要早于感病品种白沙1016,且活性最大值明显高于白沙1016。而感病品种白沙1016酶活性的下降速度耍快丁抗病品种阜花17,说明抗病品种在植株体内能够更为迅速地产生防御醛体系，更为有效的抵御病菌的侵害。综上所述，可以看出花生植株受病原菌侵染后，防御的系活性变化是其抗病性的重要生理生化基础，病菌侵染过程中防御旃在寄生生理代谢中起重要作用，而寄主的抗病性是建立在一系列的物质代谢的基础上，是有关抗病性基因通过表达，来控制物质的产生来实现的。防御施活性可以作为品种对花牛.疮摭病抗性的个重要指标，而病菌侵染后有关防御前基因的表达还有待于今后进步研究。