植物中程序性细胞死亡（PCD）的诱导可能是有益的或有害的.docx

植物中程序性细胞死亡（PCD）的诱导可能是有益的或有害的。在动物中,编程型细胞死亡在植物中发生,作为正常生长和发育的部分,包括繁殖，种子发芽，气管形成，气管元件分化和衰老。细胞死亡途径的调节也发生在对环境非生物胁迫的反应中。此外，细胞自杀程序在病原体攻击期间被激活，在一些情况卜与抗性相关，例如通过定义为PCD形式的过敏反应（HR）新证据表明，在死体营养型的真菌-植物相互作用中，宿主细胞死亡对于病原体而言与植物相反是有益的，表明病原体主动参与影响指导细胞死亡的宿主途径。我们一直在研究在广泛宿主范围死体营养型真菌，核盘菌的致病性发展。这种子囊菌引起400多种植物疾病。这些疾病在遗传上难以控制，因为育种计划的成功有限。管理策略，包括作物轮作，由于广泛的真菌宿主范闱（几乎所有双子叶植物）而受到阻碍，并11喷雾方案已经大部分无效，特别是当高温条件有利于真菌时。双曲曲核的发白也有助于核盘菌属的致病成功。菌核是高度黑化和环境耐久的结构，其可以越冬并且在士壤中保持存活多年。W核作为接种物的主要来源，能够通过直接发芽感染宿主，或者它们可以通过子囊盘发展产生子囊抱子。核盘菌属分泌多种物质以促进其死体营养型生活方式。除了细胞壁降解的之外，草酸（OA）在已知发病机理和久菌发育中起关键作用。Sc1.erotiorum的草酸盐-缺陷突变体在所测试的所有宿主植物上都是非致病性的，并且也不能发展出菌核。草酸分泌可以以几种方式增强核盘菌属的毒力。首先，在植物组织（例如多聚半乳糖醛酸榆）侵入期间分泌的许多真菌能在低PH下具有城大活性（Bateman和BeerI965）。与PH的潜在盘要性一致,核盘时丝裂原活化蛋白激励（MAPK）克隆，表征和显示为在核盘菌中形成菌核所需的。这种Erk样MAPK（SMKI）的基因表达通过OA介导的酸性PH激活。如果PH不降低，则不发生病原性发展。第：，OA还可以通过细胞壁Ca2+的酸性或螯合作用来降解或削弱植物细胞壁。第三，OA晶体已经在植物中发现并且可引起血管堵塞。OA是宜接毒性的，起非特异性植物毒素的作用。我们已经表明OA还能够抑制宿主植物氧化爆发，这是植物防御反应中最早和最普遍的之一。最近，OA1.I报道干扰保卫细胞的功能，导致异常的气孔开放和抑制脱落酸诱导气孔关闭期间感染.因此,显然，当与宿主植物相互作用时，该“简单”二段酸被隹菌以多种方式使用。多功能OA对于核盘菌病原性成功的重要性由以下事实突出：OA突变体是非致病性的，即使真菌仍保持其全部的细胞壁降解他的核心.以前的研究表明，注入外源草酸盐或应用含有分泌的草酸盐的真菌培养滤液模拟实际真菌感染的疾病症状，然而,尚未建立宿主细胞死亡发生的方式。我们已经表明，哺乳动物抗凋亡基因表达的转基因烟草对核盘曲属（Sc1.erotinia）攻击具有抗性，表明致病性/细胞死亡是一种有活性的基因导向过程。根据这个前提，烟草中的核盘菌属诱导的疾病在动物中共享细胞凋亡样细胞的特征，例如DNA断裂和染色质浓缩.这表明真菌来源的些组分在植物中诱导或指导PCD。涉及其他宿主-死体营养型病原体系统的研究报道了类似的观察。合起来，坏死性真菌可以选择植物宿主细胞死亡途径以建立相容性。在本报告中，我们显示核盘菌属分泌的OA是植物中的PCD的激发剂，并负贡诱导疾病发展过程中植物的凋亡样特征.这种PCD时于真菌致病性是必需的，并涉及活性氧（RoS）。我们建议OA功能通过在负贵PCD的植物中触发途径。因此.经由0A.SderotiOrUm可以使宿主细胞死亡调节机制作为致病成功的手段。此外，由硬皮菌的OA分泌不是H接毒性的，而是可以作为信号分子。烟草中的凋亡样细胞死亡由草酸诱导。我们以前的研究表明，用Ssc1.erOtiorUm接种烟叶导致疾病和病变形成，其在细胞水平上通过DNA断裂和切割（DNA梯度和TUNE1.正反应细胞），与凋亡样PCD相关的特征。为了确定核盘菌属细胞提取物是否含有引起植物PCD诱导的一个或多个组分，用来自野生型1980菌株或非致病OA缺陷型突变体（A-1）的提取物处理烟草叶网片和幼苗。两种菌侏在100m1.的PD,pH7.0中培养,并以相等的速率生长。注意到培养基中PH的显着但预期的变化;在培养6天后1980或A1的PH分别为3.35t.13或5.47±0.16对于野生型和突变体培养物，OA浓度分别为4.35±0.12或016±005mM当植物组织用培养灌液处理时，仪在野生至海液中观察到DNA梯状。当野生型滤液高压灭菌时，DNA梯状和疾病症状仍然明显（图1C;数据未显示）。这些数据反对来自滤液的蛋白质组分负责细胞死亡诱导活性。因此，我们将注意力集中在一个明显的候选人OA上。基于我们的初步数据和以前的研咒,用草酸钾（K-OX）,pH7.0处理烟草叶片。72小时后,用20mM草酸钾处理的叶秋中出现水浸泡损伤（1A）,此外，幼苗处理对于5mM草酸钾的DNA梯状和疾病症状显示类似的反应（数据未显示）«使用伊文思蓝染色测Q烟叶叶片中细胞死亡的定量和时间过程分析（图IB）.在草酸钾和水的处理中观察到细胞活力的显着差异，直到开始处理后48小时。然而，从48至96小时，在草药处理的叶片中观察到细胞死亡的显著增加。到96h,广泛的细胞死亡和组织崩溃发生。较低浓度的草酸盐（例如IOmM）产生.类似但延迟的结果（数据未显示）。因此，草酸盐以剂量和时间依赖性方式诱导植物细胞死亡。基于响应草酸的细胞死亡的动力学,在几个时间点分离烟草DNA.观察到导致与凋亡性细胞死亡相关的特征性DNA梯状模式的DNA切割（图1C）。在观察到肉眼可见的疝状之前，在草酸盐处理中检测到DNA梯状。DNA断裂似乎对OA是特异性的，因为其他酸如柠愫酸，琥珀酸和盐酸不产生DNA梯（图2）DNA裂解也不依赖于草酸盐制剂，因为OA,草酸钾和草酸钠均引起DNA梯状（图2,因此表明PCD。导不是由于草酸林的酸性,而是由于草酸盐本身的性顺。此外,向A1.培养物滤液中加入IomM草酸钾（pH7.0）诱导DNA梯状（图IC）。当番茄叶用20mM草酸钾预处理时，A-I突变体显示疾病表型的部分恢更（数据未显示）。总之，真菌分泌的草酸盐负责烟草中的诱导踊亡样PCD，pH和光对烟草中草酸诱导的细胞死亡的影响。PH是核盘菌病发病中的田：要因子。为了进一步评价PH对草酸盐诱导的细胞死亡的影响，我们比较了各种PH相对于草酸盐介导的细胞死亡水平的影响（图3）。叶片用用HC1.调节至pH3至6的草酸钾处理.pH明显对症状有影响（图3A），因为pH3条件导致植物组织的广泛黄化和水浸泡;pH5和6显示较轻的症状，但组织死亡是明显的。出要的是，仪在pH5和6而不是在pH3或4观察到DNA梯状（图3B）。柠椽酸讷，其在调节PH和鳌介的以及抑制植物氧化爆发的能力方面类似于草酸盐（CeSSna等人，2000）,也用作对照。在所使用的任何PH条件卜.没有观察到DNA梯状。这些观察结果与草酸盐对植物PCD的特异性诱导一致，其独立于其酸性PH（4.0）调节性质。据报道，PCD通常需要光.为了确定光是否是草酸诱导的细胞死亡所必需的，将草酸盐处理的叶片在室温或黑暗中在荧光灯下温自48小时（图3C），与对照相比，在光和暗条件下的细胞死亡被显者诱导。然而，较大比例的细胞在黑暗条件卜.比在光照条件卜死亡。这些结果表明黑暗条件可能增加烟草植物的草酸诱导的细胞死亡或光具仃抑制作用RoS叁与草酸创导的细胞死亡ROS（例如，过氧化氮和超氧化物）的产生被充分证明为植物时生物应激的最早和最普遍的反应。这种受控反应的频繁结果是通常口植物抗性相关的PCD,通常称为HR,氧化应激也是哺乳动物PCD的触发因素。在植物中,氧化应激显示诱导凋亡的特征,包括DNA梯状，染色痂凝聚和细胞被缩ROS调节也被认为是种发育信号，并且涉及调节几种真菌的致病性.因此，我们有兴趣确定Rc）S是否参与核盘菌病发展，更具体地说，它涉及PCD。叶片用KQX处理24小时,然后用33;氨基联苯胺（DAB）染色，其通常用于检测H2。2。所有叶盘在周边具有轻微染色材料的环，可能是由于伤口的结果（图4A）。然而,经KgX处理的叶盘全部严重染色,并且与对照盘明显不同.染色强度也是剂证和PH依赖性（图4A和B）。用调节至PH3至6的K-OX处理烟草：叶圆片24小时。在pH5和6处理的叶世用DAB阳性染色;在pH3和4F的盘不是（图4B）。如我们所示，草酸盐诱导的PCD在相对较高的PH（5至6）F发生，并且在酸性PH（3至4）下没有观察到.因此,在酸性PH下没有检测到ROS的观察与PCD的映乏一致。在发生DNA梯级的较高PHF,ROS增加相应明显。因此,在ROS水平和草酸盐诱导PCD的能力之间存在非常好的关系。我们研究了ROS解毒随超氧化物歧化酹（SOD）,它将超氧化物转化为H2O2,过氧化氮院将H2O2转化为水，对OA诱导的PCD产生影响。叶片用过氧化氮酊或SOD用K-OX.pH5.5同时处理，并且在处理后24小时用DAB染色，在出现水渍损伤之前。HaOz产生被过氧化氢的抑制（对于IOmM为40雎位，对于20mM的K-OX为200堆位）（图40,然而，SOD不减少与K-OX共处理中的HXh产生，并且实际上在更高的SOD处理中增强了H2O2水平（图4D）。因为SOD增加了HzOa水平，所以这个结果并不完全出乎意料。与这些观察致，在这些处理中的DNA梯度的诱导显示过氧化氢酶抑制DNA梯状，SOD没仃（图4C和D）.因此，K-OX产生作为过氧化氢的但不抑制SoD的H202。H2O2代也是指示PCD的DNA梯状形成所需的。抗氧化剂的应用或CED-9的表达防止烟草中OA诱导的PCD.我们的数据表明S.sc1.crotio11m诱导植物病害涉及激活的通路终点PCD,为了深入了解介导S.sde2tiorum（A）诱导的植物PCD的途径或途径组分，各种忒剂，包括蛋白酹抑制剂E-64,抗轴化剂N乙酰半胱氨酸（NAC）和二亚茉基碘（DPI），钙流入阻断剂氯化铜1.aQ3）和维拉帕米，过氧化氢税抑制剂3-殃基三哩（3-AT）,从头蛋白合成抑制剂环己酰亚胺和丝氨酸/苏氨酸蛋白激的抑制剂K-252a用于处理具有或不具有K-草酸盐以评估对草酸盐诱导的PCD的影响。DNA梯形成用作读出，因为与DNA梯状，细胞死亡和病变形成具有一致的相关性。在使用的浓度卜.，没有化学品雌独诱导细胞死亡。DP1.是NADPH氧化陶（其产生.超氧化物）的抑制机其防止由10和2（）nMK-OX诱导的DNA梯状（图5ANAC的效果较差，E-64是一种半胱双酸蛋白酸抑制剂。3-AT对草酸盐诱导的DNA梯级的抑制没有影响，如预期的，（在图IC和图5A之间的IOmMK-OX处理中观察到的梯状差异归因于图5A中增加的DN浓度）。使用伊文思蓝染色测量草酸诱导的细胞死亡与DP1.结果一致；DP1.显若阻止植物细胞死亡（图5B）,表明NADPH氧化酸参与PCD的诱导。与维拉帕米，放线菌酮或K-252a以及较小程度的1.aC1.3的共同治疗对草酸盐诱导的细胞死亡几乎没仃影响，表明草酸盐诱导的细胞死亡可能不需要钙尚子通道活性，从头蛋白质合成，或一般丝纸酸/苏妖酸蛋白激醉活性。以前的研究描述了表达哺乳动物凋亡和对核盘菌属的抗性的负谢节子的转基因烟草植物的生成.挑故（DiCkman等人2001）。因为草酸盐是烟草植物中细胞死亡的激发剂，我们测试了表达CED-9的转基因烟草对草酸盐的反应。CED-9是来自线虫Cacnorhabditisc1.egans的Bc1.-2家族成员，并且是嫡虫中发育性PCD的良好抑制剂（Hengartner和Horvitz1994）在表达CED-9的转基因烟草中，细胞死亡显岩降低（图5B）,与我们以前的显示增加的抗病性的数据一致。时论PCD是真核生物调节正常生长和发育以及应激反应的主要过程（VaUX和Strasscr1996）.越来越多的证据表明，PCD的不当调节可能对生物体产生可怕的后果在人类中，当PCD通常不会发生时，可以促进癌症。或者，当细胞死亡时，当不应该发生时，观察到帕金森病和神经病症。因此，给定PCD方案的潜在益处明显是上下文相关的。在植物-病原体相互作用中，历史上PCD通过HR与植物抗性相关.HR和随后的细胞死亡与氧化爆发期间ROS的积累相关（JabS1999）,根据定义，HR是程序性死亡和共享哺乳动物细胞凋亡的特征（Dickman和Reed2003：Heath2000）在这个报告中，我们显示OA,致病性的致死性真菌植物病原菌的核心决定因素，使用草酸盐引起烟草中的凋亡样PCD,诱导这种真菌介导的植物细胞死亡过程是必需的致病成功。因此,在植物组织中发现的水平的非特异性植物毒素OA看起来不是直接毒性的，而是作为信号分子或激发剂发挥作用以颇倒和翦定向宿主途径朝向细胞死亡。我们的数据还表明ROS参与与宿主植物的核盘菌的相互作用。RoS也被认为对细胞有害，因为它们可以是毒性的，导致对蛋白质，脂质（膜）和核酸的损击。然而，现在显而易见的是，低浓度的RoS具有作为细胞信号传导途径中调节分子的有益功能，由于其扩散性，受控生产和调节，ROS,特别是H202可以作为第二信使，表明病原体内和宿主-病原体串扰期间的细胞内和细胞间信号传导是决定这种相互作用的最终结果的关键组分。此外，我们的数据与前提是坏死性植物病原体与其宿主相互作用的方式比最初考虑的更加微妙的方；rb并且坏死因子作为病原体的成功可能不是简单地归因通过降解的的“暴力”毒素。符合这个想法是观察到的维多利钝寄主选择性毒素维多利亚不直接杀死植物细胞，但诱导燕麦中的凋亡样细胞死亡以及诱导“防御”反应（NaVarre和WOIpenI沙）；Tadae1.aI.2001;Yao等人2001）此外，ROS在植物真菌互相关联中具仃作用。Epich1.oefestucae需要真菌产生的ROS来调节其与多年生黑麦草的共生共生（Tanaka等人2006）。在REM1.筛选中鉴定共生所需的基因，发现真菌NADPH氧化菊（noxA）敲除不仅导致共生性的丧失，而且有趣的是，致病性随后发生.第二个真菌E.Iestucaenox基因的缺失没有这样的效果。在野生型而不是突变型关联中，在两个配偶体之间的界面处检测到ROS积累，表明或菌ROS产生对于维持共生和可能防止失控的细胞死亡是必要的（JabS等人1996）。广泛的宿主范围坏死性真菌BOIryIiSCinerCa还在发病期间谢节氧化还原环境（Unger等人2005;VanBaar1.en等人2004）。在Iudzynski及其同事的实验室中的工作表明，灰倒葡泡Cu/ZnSOD的缺失突变体导致豆叶上病变形成的显着减少。葡韵糖氧化醉基因的类似敲除突变体显示对毒力没有影响。因为两种曲都能产生H202,所以证明了SOD的特殊田要性（Ro1.ke等人.2004）,这些数据还表明ROS代对于坏死性真菌毒力的盎要性。同一组还表征了来自C1.aviccpspupurea的转录因子（CPTF1）,其响应于细胞氧化还原状态并负贵细胞氧化还原状态。CpTFI的敲除降低毒力并且不再响应于敲除突变株中的辄化应激（NathUCS等人2004）。与我们的工作相关的是观察到突变体接种的植物具有显着员的H202,其在野生型接种中没仃观察到。因此，在宿主真菌相互作用的上下文中的C1.aviceps氧化还原调节可以具有双重功能：诱导ROS用于疾病发展和调节植物氧化爆发防御反应。这种对病原体的真菌和宿主氧化还原环境的双重调节与我们在S-Jic1.erotiorum中所做的观察致。草酸盐抑制宿主植物氧化爆发。氧化爆发，02和H202的控制棒放，是在病原体攻击后在植物中观察到的最早和最普遍的反应之一（Ape1.和Hin2004;Bo1.we1.1.1999;Torresea1.1998）。这种响应发生在兼容和不兼容的响应中，尽管定时和幅度可能不同。氧化爆发也发生在植物发育期间（FOrCman等人，2003）,并I1.在大多数（如果不是全部）植物物种中表达（BOIWe1.1.I999）。还已知氧化爆发在低PH下被抑制（1.CgCndre等人，1993）。因为草酸盐的解放可以降低pH,我们假设OA可以通过抑制或抑制宿主植物的氧化爆发加强真菌致病性。在生化研究中，我们表明这是体外和体内的情况（CesSna等人2（）（X）.,非致病性OA突变体不能抑制植物ROS诱导。重耍的是，草酸盐阻断氧化爆发，即使在通路的最佳pH，.这些数据揭示了以前未被认识到的由核盘的屈的草酸分泌的功能，即抑制ROS的产生，从而损害植物防御反应。我们显示OA和核盘菌屈。增加植物中的RoS水平并诱导DNA梯状和TUNE1.正反应细胞，所有这些都是凋亡样细胞死亡的标志。因此，OA似乎是ROS信号传导的中心，引起宿主的程序化样细胞死亡，这与坏死性死亡一致。草酸盐诱导的ROS产生和PCD活性也与PH相关。草酸盐在更而的PH（5至6）下诱导PCD和阳性DAB染色;这些特征在相对酸性条件（pH3至4）卜.没有观察到，尽管发生细胞死亡。此外，当用OA和DP1.共同处理细胞时，不仅RoS减少，而且DNA梯级也被消除并且未观察到病变形成。因此，存在明显的双肃RoS调节方.案：Ssdcroiiorm通过OA下调植物氧化爆发，可能以不依赖PH的方式（CeSSna等人2000）;同时还以PH依赖性方式产生RoS,这是诱导PCD途径所必需的.一个关键问题是：真菌如何抑制植物防御反应中涉及的RoS生产，同时诱导ROS促进相容性？可能地，在病原体进入宿主组织期间发生的OA和随之发生.的PH变化存在时间差异;在早期阶段，ROS和PCD在相对高的PH（5）下由低水平的OA触发。随着OA积累，PH降低并且相互作用在性质上变得更坏死，这伴随着ROS和PCD的抑制,使得病原体进一步进入植物组织。我们使用化学处理作为第一通道，以了解介入PCD的球员和途径。E-64,半胱犯酸蛋白朝抑制剂，部分阻断的PCD,如同1.aCI3.钙通道阻断剂。DP1.仃效抑制草酸盐处理的叶片中的DNA梯状和细胞死亡，表明在真菌诱导的PCD期间涉及NADPII氧化的介导的RoS“相反，3-AT,一种过氧化氢酸抑制剂，没有表现出这种类型的抑制能力，如预期的（图5）。在楠圆芽胞杆菌诱导的PCD中也注意到类似的观察（VanBaar1.en等人2（X14）。OA是多功能的并且是植物PCD的诱导剂.多年来，OA已被认为是核盘菌属致病性的关键决定因素，最初因为在高浓度（10mM）的病变植物组织中发现OA。因此.这种相关性导致关于OA分泌如何增强核盘菌属毒力的推测（DImUn和EVanS1996）,我们已经增加了这种相对简单的二段酸可以执行的功能的扩展列表。已经讨论了OA卜调植物氧化爆发的能力。我们还建立OA参与致病菌发展菌核形成过程中,OA突变体不形成菌核（Godoy等人，1990）.核盘菌屈Erk样MAPK（由sink-1编码）通过PH的还原由OA活化（ChCn等人，2004）。如果PH被谖冲并且酸化不发生，则不形成菌核（Ro1.1.ins和Dickman2（X）1）以前，我们显示所选哺乳动物细胞凋亡抑制剂的表达保护烟草植物免受核盘的属物种的感染,表明PCD可能在真菌中在植物中诱导。与这个想法一致的另外的观察是，在野生型易感烟草的真菌感染期间，观察到DNA梯状和TUNE1.阳性反应的植物细胞.我们的结论是，S.Sc1.crutiorum是劫机厂机械诱导PCD,这里提出的工作的初始基础是鉴定负贲细胞死亡诱导的分子。当用这些提取物处理烟草叶组织时，真菌提取物诱导DNA梯度，病变形成和细胞死亡.煮沸或高压灭菌的提取物产生相同的结果，因此表明贵任方不可能是蛋白质。虽然我们不能排除负贡PCD活性的未知的热稳定非蛋白班因了、但是几条证据与OA是植物PCD的特异性激发剂一致：i）在几种制剂中加入OA诱导DNA梯度和时间-和剂量依赖性；ii）OA缺陷型非致病突变培养物源液不显示梯度;然而，当OA被外源供应时，梯形恢复:和iii）其它类似浓度的有机酸不能诱导梯子.与这些观察结果一致的事实是OA诱导的PCD在酸性pH（3至4）而不是在PH5和6诱导。低PH可以引起细胞死亡，但是其似乎不是程序化的，并且可能是坏死型死亡。因此.OA诱导的PCD不是由于我们已经显示在核盘菌属菌种的核盘发育期间有效的PH信号传导。通过OA激活的MAPK（CThen等人2（X）4）。因此，草酸盐的一些其它性质是其诱导PCD的能力的原因。氧化胁迫信号传导是植物和真菌发育以及植物胁迫反应和PCD的关键组分，并且似乎是由草酸诱导的。当烟草叶片在引起PCD（由组织死亡和梯状形成证明）的条件卜用KOX处理，随后对H202进行DAB染色，植物组织被阳性染色，表明ROS产生与H202的存在一致是观察到过氧化氧酸显着阻止染色和疾病，而植物组织的SOD处理可忽略并且在一些情况下增强的效果。此外,DNA梯形被过氧化氮前抑制，但不被SoD抑制。当K-OX处理的组织用DP1.处理时，不仅ROS减少,而且DNA梯状（指示细胞死亡）也被消除。草酸盐是植物蛋白的发芽家族的底物，其在许多植物物种中发现（1.anC等人，1993）。发芽具有草酸氧化酰活性，导致草酸盐转化为H202。已经提出通过草酸氧化物产生H202在植物对抗生物和非生物胁迫的防御中起作用（Berna和BCrniCr1.999;HUrkman等人1994）。此外，表达单子叶草酸氧化酹基因的转基因双子叶植物（大豆和向日葵）显示出对核盘菌属的抗性增加。这可以解释为什么Sx1.erotiorum限于双子叶宿主，其似乎没有草酸氧化酣活性（CObCr等人2003;HU等人2003）。我们正在探索这种可能性。我们得出结论,S.sdemIiorUm分兜的草酸盐诱导植物宿主中的ROS.其似乎触发PCD途径,导致植物细胞死亡和产生合适的环境生态位用于真菌致病性发育,营养物获得和建立坏死关系。因此，对于许多植物病原体相互作用，疾病相对于抗性的结果取决于哪个配偶体控制细胞死亡过程。