《乳与乳制品金黄色葡萄球菌定性检测 Petrifilm测试片法》编制说明.docx

团体标准乳与乳制品金黄色葡萄球菌定性检测Petrifi1.m测试片法编制说明（征求意见稿）一、工作简况1、任务耒本文件的中国出入境检验检及协会提出并归口，中国海关科学技术研究中心作为本文件组织协调单位，根据中国出入境检验检疫协会团体标准化工作委员会2022年笫批团体标准制修订计划，由中国海关科学技术研究中心、内蒙古伊利实业集团股份有限公司、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公E、北京三元食品股份行限公M、河北三元食品有限公M、新希里乳业股份有限公司、纽勤生物科技上海有限公司等单位共同卷写起草，计划于2024年I1.底前完成该标准的制定工作.2、主要工作过程与工作计划2024年3Y月：提出制定标准项目，井进行了标准立项征求意见和论证工作：2024年5月：中国出入境检验检疫协会公布计划项目；2024年6-8月：进行前期周研、存在何超分析和相关资料收集整理等准备工作,拟定了标准“编制说明”编写大纲，并起草了“标准草案”：2024年8月：召开标准启动会，恸绕标准草案进行讨论2024年9月：按照启动会专欧意见和建议修改标准草案，形成标准“征求意见蔚”：2024年940月：公开征求意见，对征求到的意见进行分类采纳处理，形成“标准送审稿”：2024年10月："开标准审定会.根据与会专家的意见，对标准送审稿进行修改完善，形成标准报批稿，将标准报批稿和标准说明一并上报中国山入境检验检疫仍会审批；2024年11M：标准发布.3、主要参加单位和工作忸成员及其所做的工作等项目责任单位I纽勤生物科技（上海）有限公司.J目参与单位：中国海关科学技术研究中心、内蒙古伊利实业集团股份有限公司、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份干j限公司、北京三元食品股份有限公司、河北三元食品有限公司、新布里乳业股份有限公F、纽勤生物科技（上海有限公M.本标准主要起草人：赵晓娟、王易、李志后、孙英丽、速刚、喘东成,张双、杨宇、赵珊、孙炜、咫忠悦、宋艳梅、王航、于宝军、张洪沂。二、标准制原剜和主要研究内容1、制原则全国人大常委会在2017年I1.月4日审议通过新修订的标准化法，该法第二条规定：”标准包括国家标准、行业标准、地方标准和团体标准、企业标准.”从法律上进一步明确了团体标准地位。我国现行的法规体系中，国家标准、行业标准、地方标掂属于政府标准，由政府主导制定：团体标准和企业标准属于市场标准,H1.市场自主制定.政府标准与市场标准协同发展、协调花套,市场标准除了快速反应市场衢求外，其承我的一个理要功能就是创新.本标准立足国内食品安全发展实际，在符合国家食品安全相关法律法规、标准要求的前提下.引入国际上最新的微生物检测方法.完成本土吸收转化后,制定出具有较大行业影响力的、规范严谨、可行性强的标准检验方法文件。同时，标准制定工作还遵循“面向市场、服务产业、自主制定、适时推出”的原则，将标准制定、成脸脸证、应用推广相结合，统筹推进.标准的编写结构和内容编排等方面依据GBjT1.1.£标准化工作导则3、GB,T20000£标准化工作指南？等系列标准的要求,我点对标准适用范用、检验步骤等关键要素进行了明确，以突出标准的科学性、可靠性和合理性的特点.根据我国食品安全国家标准GB29921-2021预包装食从中致病菌限瓜，对于巴氏杀菌乳、谢制乳、发佛以、加糊炼乳（甜炼乳）、调制加铺煤乳要求采用比较严格的二级条样方案，金我色前的球菌的限量为：n=5,c=2.m=O1'25g（m1.）.检验方法按GB47S9.10第一法金黄色削起球作i定性检验执行，基国家标准的要求，本标准在制定的过程中，结合相关使用单位的生产现状，综合研究了金黄色询群球曲定性榜龄的各类快速检蛤方法，其中PC1.rifi1.m”测试片法以其良好的灵败度、特异性、排他性等技术优势在各乳制品生产企业具有广泛的应用，可以帮助企业提而检测效率、缩短检测时间、加快产品放行，同时操作更为简便、更加节省空间，从而减少误差和降低旎耗.此外,PCE川mi«试片法作为国内外广泛应用的检5金方法,已经被AOAC定为官方方法,同时也纳入了我国出入境检验检授行业标准，但是均为定成检验方法.因此金黄色依I®球的PeEn1.miitt试片法定性检脸标准的提出和制定，埴补了方法空白，同时有利于协调统一该标准在技术上的先进性、经济上的合理性以及应用中的适用性。2,主襄研究内容Pctrifi1.m金黄色碗面球菌测试系统山测试片和确认片两部分组成.是基F预制的选择性培养基和阳性结果确认技术对金黄色偏荀环衡进行检测,其检测原理为：PC1.rifiIm金黄色匍曲球曲测试片含改良BaiM-Pmer培养翦,该培养域配方具有一定的选择性.可以抑制非目标菌的生长：同时测试片培养基配方含有特异性指示剂.金黄色相药球菌是唯隹将指示剂转化成紫红色色素的细曲，可区分目标的金黄色SjQ球储和非I1.标的，当样品中背景值较而时，测试片中的抑制成分不能完全抑制背景阳，可能会使菌落显示非紫红色（例如.衡落呈现黑色等），故需要用确认反应片进行确认.确认反应片含脱氧核糖核酸（DNA）和指示剂（甲素胺篮，蚯色染料，可以确认非概红色的落是否为金黄色他箱球做,金黄色简荀琼茵产生脱轲核糖核酸侪（DNaSC）,该侪会分解确认反应片中的DNA.分解的DNA与确认反应片中的蓝色染料发生反应，产生物红色量曲.金黄色葡荷球甫确认反应片是可选的步骤,当出现第红色以外的其他颜色的崩落时，需使用确认反应片.本标准的研制根据GB4789.45-2023食品安全国家标准微生物检验方法验证通则.以GB478910第法作为多考方法，对Pe1.rifiIn1.金黄色面箱球的枪试片法的包容性、排他行、方法灵敏度等方面进行了研究。金黄色前葡球薄定性检测Peirifi1.m测试片法与GB4789.I0第一法相比，在校测时间上大约只需45h,而GB4789.I0第一法最少需要77h左右.金黄色葡葡球菌定性检测Petrif1.1.mitt试片法在检测时间上可以缩JS32h,两种方法的检测流程见图I,两种方法在其他方面的比较见表I.»V±1.tIUk-M*tM<>u<f*.*THMt«nB.GB4789.10-2016第法检测流程AJetrifi1.m金黄色僚箱球馆测试片法检测流程图1.两种方法的检测流程表I金黄色削豺球他定性检冽Petrifi1.m测试片法与GB4789.10-2016笫-法的比较培养茶和试剂种类工作吊结果观察G染色金黄色独凿球能定性检测Pe1.rifi1.m测试片2小不需要GB4789902016第一法4大复杂脩要根据GB29921-2021预包装食品软病的限量中对于金黄色I1.ii的球赭的规定，本标准的制定旨在协助乳制品企业建立金黄色葩荀环菌的快速定性检测方法,因此本标准检验方法适用于巴氏杀小乳、调制乳、发解孔、加糖炼乳（甜炼乳）、调制加糖炼乳等乳制品中佥黄色前的球南的快速、定性检验.三、主要试验（或改证）情况根据tGB4789.45-2023食品安全国家标准微生物检股方法脸证通则B对于“定性方法”的验证,实段室内部验证指标（参见GB4789.45-2023表1）包括：灵敏筏、包容性和排他性共计3个指标的监证，实验室间验证（参见GB4789.45-2023&I）进行方法以敏僮的验证.首先确定两种检验方法是“配对还是非配对分析）依据GB4789.4S-2023对“配对/非配对检验”的解释即“2种定性方法同时检验某一样M时,若第一步增苗方法相同，可使用该样M的同一试样进行分析，该分析称为'配对分析；若第一步增雨方法不同，则使用该样品的不同试样分别进行分析,该分析称为'非配对分析本研究的PCtrifiIm金黄色葡葡球菌测试片方法与GB4789.1O2OI6的第法采用阿个检样”，履使用问个“25g（m1.）M的样品，用网-种增溶液即“7.5%氯化钠肉汤”,从同增的液中取增两液按照GB4789.132016的第一法接种BP<Baird-ParixrT'板和血;'板,PctnHIm金黄色葡荷球菌测试片方法接种Pctri1.i1.m金黄色葡萄环菌测试片.因此，本方法验证属于“配对分析”.1 .险证实险重的逸界选择具CNAS和CMA资质，菌椽资源丰田，具有方法验证和制定标准经聆的政府实验室或第三方实蕤室；蕤证实验室负近祖建方法验证团队，验证团队应由23名成员祖成，其中一人为本研咒的负责人.本次验证实验室内验证选择“中国海关科学技术研究中心食品安全研究所”简称“食M安全所”.食品安全所具CNAS和CMA资质，氏期从事青生物检测试剂盒评价工作,曾制定20余项“试剂盒”类检粉检疫行业标准，在海关系统具有非常大的影响力。实粉室间脸证选择具CNAS和CMA资质的广州海关技术中心、杭州海关技术中心和中检科北京）测试技术彳11限公司.2 .殴证依据4食品安全国家标准微生物检验方法验证通则§GB4789.45-2023,3 .）比方法GB4789.10-2016的第一法4 .验证数4.1 检评灵敏度险证灵敏度研究是指参考方法或PC1.rifnm金黄色初荷球菌测试片方法检出目标微生物的能力.1.1.1 1.1代衰性食品的选界：依据GB4789.45-2023的3.2条款，即“适用范围少于5种食品种类，应全部选择。每种食品种类至少选择1种食品子类”,本团体标准适用于“乳及乳制品根据GB4789.45的“表A.I食品种类和食品子类”，选择一个子类诳行方法验证。室内骁证选用“巴氏杀倒乳”样品进行方法脸证.样品由伊利集团提供，为了验证的公平性掩蛊了样品域本信息。1.1.2 低水平阳性样本的净加实舱旅内险证检费灵度：低水平由体添加I的收为：0.7CFU/.1.,结果阳性率为60%将IH1.低浓度添加水平菌液添加到25In1.巴氏杀菌乳样品中,制备20个平行样品：阴性对照取25m1.巴氏杀菌乳样品，加入Im1.无菌生理盐水，制备5个阴性平行样M：阳性对照取25m1.巴氏杀菌.乳样品，加入7CFWm1.浓度的阳性箔悬液加的制备5个阳性平行样品：充分混匀。质fit控制：5个阴性样品均为阴性、5个阳性样品均为阳性,结果成立.检测灵敏度结果见表2。实验室内蕤证图片见图2,表2低水平阳性添加的检测灵故痣实脸结果序号参比方法测试片方法需注1+/2/3+/4+/5一/6一/7+/8+/9+/10/11+/12+/13/M一/15+/16+/17/18+/19/20+/阴性样品1/阴性样品2/阴性样品3一/阴性样品4/阴性样品5/阳性样品1+/阳性样品2+/阳性样品3+/阳性样品4+/阳性样品5+/注：+，表示阳性结果:表示阴性结果B.GB1789.10第法血平板结果A实验过程C.GB4789.IO第一法BP平板结果I).PCtrifnm金黄色面荀环菌测试片E,阴性和阳性对照图2.实蕤空内验证1.测灵敏廛实验结果图方法灵敏度R1.OD的计算(GB4789.45附录B的公式B.2>sB.2RIODMitM根*式(以2)计尊R1.（三）.R!.OI)三(B.2)HItT/(f1.-nnw1.(wwy)式中，分。方法的海KXiehy参学方法的用性站果IbBT怦q”方法的测出Qehy.他依方法的阳性结果数.根据卜述公式计算金黄色aJ荀球菌Pctrifi1.m刈试片实验室内验证相对方法检出,限（R1.OD）为I,符合GB4789.451I14.1.2中对配时检验检测灵敏度的要求.实改室同殴证检评灵【度I低水平曲体添加的量:为：0.7C"b1.,结果阳性率为50-60%将Im1.低浓度添加水平菌液渗加到25m1.巴氏杀菌乳样品中.每个实5金室制备8个阳性添加平行祥品:阳性样品取25m1.巴氏杀曲乳样品,加入7CFWm1.浓度的阳性南悬液1叽，制备2个阳性平行样品：阴性样晶取25m1.巴氏杀菌乳样品，加入Im1.无曲生理盐水，制备2个阴性平行样品.充分混勾.质爆控蒯：2个阴性样品均为阴性、2个阳性样品均为阳性，结果成立。汇总3索协同验证实脸室实5金数据于表3.实验室间验证图片见图3、图4.表3实监空间验证结果数则汇总实验室序号参比方法结果测试片方法结果备注中检科（北京）测试技术有限公司1+/2+/3+/4-/5+/6-/7+/8-/阴性样品1-/阴性样品2-Z阳性样品1+/阳性样品2+杭州海关技术中心I+/2+/3+十/4+/5-/6-/7+/8+/阴性样品1-/阴性样品2-/阳性样品1+/阳性样品2+/广州海关技术中心1+/2+十/3-/4+/5-/6+/7+/8/阴性样品1/阴性样品2一-/阳性样品1+十/阳性样品2十+/注：一;衣示阳性结果；衣示阴性结果A.Pctri1.i1.m金黄色匐与球菌测试片B.BP平板结果C.血平板结果图3.杭州海关实验结果A.Petrifi1.m金黄色偏球的测试片C.阳性对照B.血平板结果图4中检科（北京）测试技术有限公M实粉室间协同脸证的R1.OD值的计算：根据GB4789.45附录B的公式B.2计分RI.0D.实验室间协同验证的R1.OD=I.1.1.3 检费灵敏度验证结论综合实验室内验证和实验室间脸证的R1.OD为1.说明金黄色箱明球菌Pctrifi1.m测试片法定性检验乳及乳制M中的金黄色葡荀球菌的检测灵敏度与GB4789.10-20161作品安全国家标准ft品曲生物学枪睑金黄色曲球荫检脸的第一法的检测灵敏度相”1根据GB4789.45-2023的“4.1.2验证要求”,针对配对分析,R1.oD的可接受酸为1.5,R1.OD低于1.5是可以接受的.本次协同验证R1.OD为1,符合GB4789.452023对检测犬政度的验证要求4.2 包容性险证采用30株金黄色葩葡球曲分宓株对金黄色葡荷球蔺Pcirifi1.m测试片进行包容性验证.结果记录于表4.30株金黄色仙筠球的分离株，在金玳色他奇球笛Pe1.rifiIm测试片上呈现典型的紫红色菌落.结果均为阳性.衣4包容性验证用金黄色葡葡球南南株列入和验证结果序号菌株编号来源验证结果1BJ-Sa-5金章牌大孔芝士碎+2BJ-Sa-IO安佳q苏里拉乳酪+3BJ-Sa-12航食+4BJ-Sa-13航食+5BJ-Sa-14奶酪+6BJ-Sa-15巨浪大切经典原味抑片+7BJ-Sa-16脱脂奶粉+8BJ-Sa-17安佳车达乳酪（红）10.9.8-11.9.8+9BJ-SaT8安佳军达乳酪（红）10.10.6-11.10.6+IOBJ-Sa-19速冻熟玉米+I1.BJ-Sa-22鱼子越+12BJ-SH-23冷冻富格+13BJ-Sa-33贝塞斯冰洪淋+14BJ-Sa-47小小三鲜水饺+15BJ-Sa-48紫玉板栗玉汤硼+16BJ-Sa-49黑芝麻核桃汤圈+17BJ-Sa-50玫瑰花汤即+18BJ-Sia-72保利微酸奶油-3+19BJ-Sa-73九11牌炒年钛条（膨化食品）-2+20BJ-Sa-74短丫头爆米花-5+21BJ-Sta-77旺旺仙贝（含油型膨化食品）-2+22BJ-Sta-78吉利火星奶油味爆米花+23BJ-Sta-79河北稻香村老面包+24BJ-Sta-80张君雅小妹妹甜甜圈（巧克力味力味）-4+25BJ-Sta-81枕纯牛奶-2+26BJ-Sta-83冰鲜三文鱼+27BJ-StH-84油炸小龙虾3+28BJ-StH-89水解乳清蛋白粉H1.412014+29BJ-Sta-90凯瑞原味奶油奶酪样品三+30BJ-Sta-91万通牌新西兰冻虾(G2)5+注：:表示阳性结果：-：表示阴性结果4.3 排他性实3采用30椽非佥焚色仙面球南的株，包括亲线关系近的的株，例如去皮痛!0球带，以及亲缘关系远的薄株，例如植物乳杆曲等等对金黄色的司球阳Pe1.nfIhn测试片进行排他性脸证.结果记录于我5,所测试的30株非金黄色葡荷球菌荫株，均呈现阴性反应.表5排他性验证用M株列表和骁证结果序号a株名称的株弓骁证结果I大肠埃希氏1由ArcC259222大肠杆菌O157:H7CiCC215303肠炎沙门氏恒CMCC5(X)41一4甲型副伤寒沙门氏菌CMCC5(XK)15阪崎扬杆菌AFCC295446肺炎克雷伯氏菌CGMCC1.17367副溶血性弧值ATCC178028创伤弧菌CC275629福氏志贺氏僧CMCC51571IO宋氏志贺氏倒CMCC51334I1.阳沟肠杆菌CGMCC1.5712马红球菌ATCC693913发皮僭萄琼衡ATCC12228一14粪槌球菌AFCC3222315炎肠球菌C1.CC25()1916单增李斯特氏菌ATCC1393217英诺克李斯特ATCC3309018威氏李斯特ATCC3589719格氏李斯特ATCC70()54520铜假单胞菌ACC154422166氏假单胞菌AFCC1758S22白色念珠菌AFCC1023123再黄做球曲CMCC(B>28124蜡样芽抱杆曲ATCC1!77825产气荚联梭曲ArCC1312426短小芽泡杆菌CMCC(B)6320227掠物乳杆菌ATCC801428泮葱伯克留尔德菌CiCC1()85729啥热鞋球菌CiCC20248一30德氏乳杆菌CICC60775.验证结论灵故度、包容性和排他性验证结果表明，金黄色匍甜球菌PC1.rifi1.m测试片的包容性和排他性均为100%,针对金黄色传荀球衡的检验特异性良好：经实验室内和实验室间验证，金黄色葩筠球的Pe1.rifnm测试片的检测灵域度与GB4789.IO2OI6食品安全国：切求食品微生物学+黄色葡以茵戊验的第法的检1灵故度相jR1.OD结果为1.金黄色葡萄球曲PCtrifnm窝试片可用于乳与乳制品中金黄色仙的球的定性检验.六、与国际、国外对比情况与同类标准的比较本文件制定过程中未查到同类国际、国外标准.七、与现行相关法律、法短、牌章及相关标准，符别是强制性标准的岱调性本文件与现行相关法律、法规、现枇及相关标准，特别是强制性标准完全保持一致,八、重大意见分技的处理经过和依据标准制定过程中未发生由大分歧意见。九、贯物标准的要求和措建议建议本文件批准发布6个月后实施。十、废止现行相关标准的建议无十一、其他应予说明的项无£扎与乳制品金黄色价萄理曲定性检测Pe1.ririIm测试片法标准起草工作组2024年9月23H附件1.团体标准就与乱制品金黄色前留理赭定性检脸PSrifiIm测试片法？脸证评价方案附件2.中国海关科学技术研究中心食品安全研咒所一团体标准:乳与乳制品金黄色箱药球菌定性检测PCtrifiIm测试片法2验证评价报告网件3.广州海关技术中心团体标准£孔与乳制品佥黄色偏劲球曲定性检验PeIriEm测试片法办同实脸室验证报告附件4.杭州海关技术中心一团体标准C乳与乳制品金黄色相葫球菌定性检验Pctrifi1.m测试片法协同实验室验证报告附件5.中检科（北京）测成技术有限公司团体标准£乳与乳制品金黄色独凿球苗定性检验Pe1.rifi1.m测试片法协同实脸室脸证报告