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重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略摘要大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素，并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤，总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。关键词：大肠杆菌表达体系；重组异源蛋白质；可溶性表达；包涵体；糖基化大肠杆菌因其培养条件简单、培养周期短、易于高密度发酵、重组蛋白质表达水平极高和极低培养成本等诸多特点而被广泛用作重组蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。尽管大肠杆菌表达体系有许多优点，但是在实际应用中也仍然存在一些不足之处，主要包括：(1)缺乏翻译后修饰。相较于真核表达体系，原核表达系统最大的局限性之一在于其缺乏类似于真核生物翻译后修饰的能力，如糖基化修饰、二硫键氧化形成等。这些修饰与重组蛋白质的可溶性、稳定性及生物活性密切有关。(2)无辅助蛋白质折叠机制。原核表达体系缺乏辅助蛋白质折叠机制，重组蛋白质在原核表达体系表达过程中通常以一种自发折叠的方式形成特定结构，对于部分结构复杂、疏水性强的蛋白质易于导致错误折叠，最终形成无活性的包涵体(IBS)。据估计，大约只有30%异源蛋白质可以在大肠杆菌中以可溶性形式表达，其余以包涵体的不溶性聚集物表达，或在细胞提取物中无法检测到，是蛋白质生产和纯化过程中不可忽视的瓶颈，所以通过优化表达策略，改善异源蛋白质在原核表达体系中的可溶性表达也是目前研究的焦点。可溶性和功能性蛋白质的制备获取是生物工业应用的主要目标之一，自然途径难以获得令人满意的产量，通过具有成本效益和易于扩展的原核表达体系生产可溶性和功能性蛋白质是当今功能性蛋白质获取的主要方式，尤其是在以成本控制为导向的新型合成生物学领域的应用。因此，通过选择最优表达宿主体系和最适培养生长工艺进行开发和优化目的基因表达，以最大程度减少不溶性蛋白质的生成尤其关键。尽管重组蛋白质高效、低成本表达或制备获取在学术和工业领域已经取得了系列重大成就，但利用原核表达体系进行可溶性和功能性目的蛋白质表达的需求仍未得到满足，特别是近年合成生物学技术的快速进步对低成本获取功能性重组蛋白质提出了更高需求。在过去数十年，各种生物技术的进步极大丰富了通过原核表达体系制备重组蛋白质的手段。特别是近年来，大肠杆菌底盘细胞的工程化改造进展进一步拓展了原核表达体系在表达重组蛋白质中的应用。因此，本文针对现有以大肠杆菌宿主为主要代表的原核表达体系中的可溶性表达策略以及近年不断涌现出的新生物技术进展进行综述。1、 重组蛋白质在大肠杆菌中不可溶性表达（包涵体形成）的机制1.1 自身氨基酸组成重组蛋白质氨基酸组成中含硫氨基酸及脯氨酸的数量和比例能够显著影响重组蛋白质在大肠杆菌中的表达形式，含量越高，重组蛋白质更容易形成包涵体2。（1）含硫氨基酸:半胱氨酸在蛋白质结构中多以二硫键形式存在，对蛋白质分子空间结构的构象形成和稳定起着重要作用，是影响蛋白质可溶的重要因素。在大肠杆菌胞质中表达的重组蛋白质，受胞内高度还原性环境影响，二硫键难以形成或稳定性下降，使重组蛋白质的结构稳定性下降，呈现聚集倾向。（2）脯氨酸:脯氨酸是组成天然蛋白质中唯一具有特殊环状结构的氨基酸，其特殊的结构对肽链二级结构起着极大程度限制作用，可赋予蛋白质特殊的空间结构和生物学特性，其结构的特殊性是很多蛋白质折叠与去折叠过程的限速步骤。1. 2亲疏水性强弱从本质上讲，蛋白质的折叠过程在一定程度上是由疏水相互作用驱动的，同时蛋白质的聚集过程极大程度是分子间疏水作用的结果。蛋白质分子内疏水结构之间的相互作用促成蛋白质疏水结构有序埋藏于蛋白质内部，亲水结构暴露于蛋白质表面，形成具备特定形状的稳定结构。蛋白质分子间通过尚未内埋的疏水区域相互作用，导致蛋白质聚集。分子内和分子间的疏水作用存在一定竞争关系与相互平衡。蛋白质自身亲疏水性的强弱极大程度上决定了这两种疏水作用的平衡关系。蛋白质自身疏水性越强，分子间更容易因疏水作用引发聚集，使蛋白质错误折叠的概率越大。1.3 蛋白质合成速度与真核表达系统不同，大肠杆菌的转录和翻译是快速且紧密耦合的，而快速的蛋白质合成速度对具有复杂结构蛋白质的折叠却是致命的。在大肠杆菌胞内局部蛋白质浓度高达300400mgmL,单一重组蛋白质在大肠杆菌诱导表达末期的胞内浓度可高达近100mgmL,在超强启动子作用下，重组蛋白质合成速度比真核表达系统与哺乳动物细胞表达系统快10100倍。极其快速的合成速度以及极高同质蛋白质浓度对蛋白质正确折叠带来极大挑战。由于许多真核生物蛋白质需要更长时间和/或折叠伴侣的帮助才能折叠成它们的天然状态，蛋白质合成速率提高一方面通常会导致没有足够时间进行正确的结构折叠，另一方面蛋白质过快合成使重组蛋白质折叠前体快速积累，致使缺乏足够的折叠空间，极大程度上增加了重组蛋白质之间的相互作用,形成蛋白质聚核，促使并加速更多蛋白质聚集，聚集部分折叠、未折叠或错误折叠的不溶性蛋白质。1.4 重组蛋白质分子大小及结构复杂程度大肠杆菌的平均蛋白质长度为317个残基，而人类的平均蛋白质长度为510个残基。重组蛋白质分子越大，结构往往越复杂，其所涉及的结构域通常越多，在蛋白质折叠过程中需要克服的分子势能壁垒质自身结构、氨基酸组成、亲疏水性及二硫键数量等，客观性因素包括表达场所、分子伴侣（融合/非融合）、宿主类型、诱导策略、载体类型等。改善或提高重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达的策略主要针对以上主客观因素进行优化。主观性因素结构类型亲疏水性结构复杂性契基酸组成j二破该数量,奈*-表达场所“-载体类型诱导策略£也始宿主类嬖分子伴倡客观性因索图2影响重组蛋白质包涵体形成的因素2.1 密码子偏好性优化参与蛋白质翻译过程中氨基酸识别与转运的密码子组成具有简并性和物种偏好性。在不同物种中，由于不同同工tRNA丰度存在差异，同义密码子在蛋白质翻译过程中的使用频率并不一致，特定物种使用某种对应同义密码子具有显著倾向性。大肠杆菌表达体系稀有密码子包括AGA、AGG、AUA、CCG、CCT、CTC>CGA和GTC等。密码子偏好性对重组蛋白质在大肠杆菌表达体系中的表达有着直接影响，蛋白质的正确折叠依赖于基因的顺畅表达，如含有大量单个稀有密码子或少量串列稀有密码子的目的基因在大肠杆菌中更容易出现翻译限速，甚至停滞的现象，导致蛋白质折叠错误。大肠杆菌中可用的同工tRNA的丰度与密码子之间存在着正相关性，这种关系有助于优化翻译系统,且能够平衡密码子浓度与受体tRNA浓度，提高翻译效率。因此，重组蛋白质目的基因密码子的偏好性优化对提高重组蛋白质在大肠杆菌表达体系中的高水平表达具有重要意义。有研究表明，将mRNA缓慢翻译的区域段用小于或等于天然供体密码子的同义密码子进行编码，最终使异源蛋白质的表达含量提高了41000倍。常见的优化工具包括CodonWizard>GeneOptimizer、SyntheticGeneDesigner等软件或网站。此外，密码子优化还在mRNA的二级结构分析和优化等方面有着重要应用。2.2 重组蛋白质诱导表达温度优化温度对大肠杆菌生长、质粒稳定性、重组蛋白质表达速度及蛋白质折叠效率等有显著影响。大肠杆菌的最佳培养温度一般为37,此温度可能并不总是有利于目的基因在大肠杆菌中表达。对于某些蛋白质，在37。C下其溶解度会显著降低，易形成聚集体，降低可溶蛋白质的表达比例。蛋白质聚集主要由溶剂暴露的疏水性结构之间的相互作用驱动，疏水作用对温度的依赖性决定了聚集速度，因此过高温度会加速蛋白质间的聚集程度。同时，较高温度对细胞新陈代谢有明显加速效应，适当升高温度，可显著加速重组蛋白质质的合成速度，而合成速度的加快进一步增加蛋白质折叠前体浓度的累积，增加蛋白质正确折叠的压力。在较低温度下，细菌生命代谢速度减慢，降低转录、翻译速度，较慢的翻译速率有利于蛋白质正确折叠，同时温度降低时聚集作用也得以减弱，有利于蛋白质折叠和提高重组蛋白质可溶性表达比例。值得注意的是，较低温度也会降低最终生物量，由于蛋白质合成率降低，需要更长的诱导时间才能获得理想的蛋白质产量。例如，将重组人角质细胞生长因子(KGF)的诱导温度从37降为23后，虽然KGF蛋白的表达量显著降低，但是可溶性KGF蛋白的比例得以显著提高，接近IO0%。2.3 3表达载体选择与优化表达载体通常包括复制子、筛选标记基因、启动子及转录终止子等元件，大肠杆菌的常用表达载体包括pET系列、pCold系列、pBV系列和pGEX系列等。不同载体之间包含的元件类型和数量具有明显差异。载体的启动子类型对目的基因表达水平和表达方式(可溶或不可溶)的影响非常显著。选择载体首先要考虑启动子的启动效率要足够强大，使目的基因的表达产物能够占据菌体总蛋白质的10%30%。常见大肠杆菌表达体系的启动子类型包括来源于细菌的lac、tac、trp.araBAD启动子，以及来源于噬菌体的T7、T5、SP6启动子。pET表达载体因其具有T7强启动子而获得较高表达量，是最常使用的启动子类型。T7启动子由T7RNA聚合酶驱动，其转录DNA的速度比细菌RNA聚合酶快近5倍，但这种强大的启动转录效率会导致目的蛋白折叠前体快速累积，会增强包涵体的形成概率。其他启动效率相对较弱的启动子还包括pQE30a载体的T5启动子，pMAL-C2X载体的Tac启动子，以及PBV载体的pR/pL启动子等。较弱启动子在启动转录和蛋白质翻译过程中，目的蛋白的表达强度相对平缓，降低重组蛋白质折叠前体的累积效应，能够在一定程度上改善可溶性表达情况。对比不同表达载体，发现利用pBV220质粒可在原核表达体系中成功实现无融合标签的重组rhFTL胞内可溶性表达，且能形成正确rhFTL蛋白自组装颗粒。2.4诱导策略及优化2.4.1IPTG诱导异丙基B-十1-硫代毗喃半乳糖昔(IPTG)是原核表达体系最常用的重组蛋白质表达诱导剂之一。在大肠杆菌表达系统中，乳糖操纵子表达系统最为常见。在没有乳糖存在时，Iac操纵子处于阻遏状态,转录受到抑制。当有乳糖存在时，IaC操纵子即可被诱导。IPTG是一种不可代谢的异乳糖结构类似物，通过结合Iac阻遏物，使下游插入的目的基因得以启动转录。因其不可被降解，所以诱导效率极高。IPTG的工作浓度通常在0.11mmol/L。一方面，IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录，过高浓度IPTG会极大程度启动转录与蛋白质翻译，导致翻译后重组蛋白质折叠前体的过度累积，促进包涵体(IB)形成。另一方面，若IPTG浓度过低则达不到与IaC阻遏蛋白结合的有效浓度，从而影响蛋白质产量。根据我们实验室的经验，目前绝大多数情况都存在IPTG使用过量的情况，我们发现在实验室摇瓶培养中，当IPTG使用浓度高于10molL时，在4h的诱导周期内，重组蛋白质表达水平并无明显差异，而IPTG在10molL,重组蛋白质的表达水平与IPTG浓度才呈现较好的依赖性（结果尚未发表）。因此通过调节IPTG浓度来调控重组蛋白质的表达速度，促进蛋白质可溶性表达，建议在10UnIOl/L以下浓度范围内优化。2.4.2自动诱导在大肠杆菌乳糖操纵子表达系统中，自动诱导表达策略也是常见的诱导方式。自动诱导培养基中含有成比例的葡萄糖和乳糖，大肠杆菌会优先选择葡萄糖供应能量，待葡萄糖消耗完之后才开始摄取乳糖。乳糖经B-半乳糖昔酶作用转变为半乳糖，作为一种诱导剂启动T7RNA聚合酶表达。自动诱导策略的优势是无须额外加入IPTG诱导剂，其另一个特征在于诱导开始阶段，诱导剂半乳糖的生成是循序渐进的,而在诱导末期，诱导剂半乳糖被逐渐消耗殆尽。因此，诱导目的基因转录翻译的速度是变化的，相对于IPTG诱导，自动诱导是一种更加温和的诱导方式。2.4.3温控诱导温控诱导可分为高温诱导和低温诱导。高温诱导是利用温度敏感的阻遏物clts857来控制目的基因的转录启动。在30下转录受到抑制，当温度升高至42时，clts857蛋白变构失活，阻遏解除，开始启动转录。热诱导不用添加外来诱导物，成本低，但是发酵过程中加热升温培养，细菌的生长和代谢均加速，在一定程度上加快了重组蛋白质的翻译合成速度，增加蛋白质折叠负担。升温诱导还会激活大肠杆菌表达热休克蛋白，有研究表明热休克蛋白对重组蛋白质的折叠在一定程度上起着分子伴侣辅助折叠的功能。为了克服因为升温培养加快蛋白质表达速度，引起蛋白质折叠负担增加的问题，可以尝试在诱导时将培养温度升高至42。C后维持1530min,让CItS857蛋白充分变构失活，解除阻遏，启动转录，然后再将培养温度降低至35以下，降低细菌的新陈代谢和重组蛋白质表达速度，减轻蛋白质折叠负担。低温诱导是应用冷休克基因CspA作为启动子来控制目的基因的转录启动。低温诱导能够降低大肠杆菌的新陈代谢，进而降低重组蛋白质合成速度，降低有聚集倾向的重组蛋白质折叠前体累积，一定程度上减少包涵体形成的概率和提高可溶性表达比例。为避免蛋白质以包涵体形式表达，低温诱导表达是最有效的诱导表达方式之一。2. 4.4其他诱导方式其他诱导方式还包括直接使用乳糖替代IPTG进行诱导（Lac操纵子）、色氨酸诱导（Trp操纵子）及阿拉伯糖诱导（araBAD操纵子）等,结合不同实验情况进行优化与对比筛选，获得最佳诱导方式和蛋白质产出。2 .5大肠杆菌表达宿主选择为了提高蛋白质表达水平，促进二硫键形成，提高蛋白质正确折叠，改善蛋白质可溶性表达比例，各种类型的大肠杆菌宿主细胞被设计与改造。常见的大肠杆菌宿主包括£.coliBL21系列、Rosetta系列和Origami系列等（表1）0表1大肠杆菌表达体系常用宿主亚型类型大肠汗薄宿主类型功俺应用特征抗件特征BL2I京规表运非理性里白的备水Y衣送，不能用于由T7启动F邨动的徽口被表达无BIJl(DO)含T7RNA”介像，M用于T7Je.MJE&Up信动子”制的目的&因表达尤BUIStar(DEl)RsE后因突变失活.防止转录后mRNA的快速跨解无n2l(nB>PIyW母性般白及达.翰行密码了收囚表达含有表达T7潜僭解的拉内.内胃低H的趋因的背量我达水¥.林4、就H的量白表达皿牢长IUiMMiiiji()3)*6用临行密码子质就(AlMAGG.ACA.ClA.(XC.GGA),适合含幡京密码了基因表达Pq坏案.卡郝而收RL2I(gmR(OKn才二*青白或达“助F畲二磕雄靠门的活性童门质形成Pq环索.R那方本CMgiHni2(PM)A和mM囚匕同时k行突变.利F落二破键盘门的折展'jM化凶坏京.鼠毋本.F那石家HI2IInB(DM)利行碱料还小门还喊陶突变体,利于二破波仔细葩质中形成.适合M二破/蛋白的正折及相会达卡麻肯素Krt<*tU*g>MlU(DE3)PL芦二破边弧化,特有密码了友达TrnMU“暴囚突变.科干雷臧螳来门欲确折件同时k有稀密码fIRNA氨骞水、卡邮寄京.疑毒素网环素KM*tu*ItMiu2(1)13)携带有RJGW基因突安,利于含.娥进责H硕正珑折会.同时自布11有宙码子IHNA四环素E.coliBL21及其衍生物最常用于常规蛋白质表达。这些菌株缺乏OnIPT和IOn蛋白酶。减轻T7RNA聚合酶的降解以及重组蛋白质和错误折叠蛋白质的降解。其中，BL21Star在RNA基因中含有一个额外突变。该基因编码RNaSeE,在细胞内主动降解11RNA,因此,该菌株的特征在于mRNA稳定性增强，进而导致蛋白质表达增加。与无RNaseE缺陷的BL21菌株相比，异源蛋白质表达可显著增加210倍。Rosetta宿主的特点在于可提供编码罕见tRNA的质粒，以促进含有高频率罕见密码子基因的有效表达。OriganIi系列菌株的特点是在硫氧还蛋白还原酶(trxB)和/或谷胱甘肽还原酶(gor)基因中存在突变，这两种蛋白质维持细菌胞质的还原环境，有助于胞内二硫键的形成，因此更有利于含二硫键重组蛋白质的正确折叠和可溶性表达。此外，以上不同宿主的各种功能性组合，如Rosseta-gami等，极大丰富了大肠杆菌表达宿主的功能性需求。3 .6胞内表达与分泌表达通常情况下，大肠杆菌表达重组异源蛋白质采用胞内形式表达，具有表达量高的优势，但是大肠杆菌高还原性及缺乏折叠伴侣分子的胞内环境导致部分蛋白质在胞内表达时易形成包涵体。此种情况下，还可以考虑分泌表达。大肠杆菌周质对分泌蛋白表达具有极大吸引力,其具有以下特征:第一，通过特定的C-信号肽酶切割N端序列，形成与重组基因产物完全匹配的N端氨基酸。第二，与细胞质相比，周质中的蛋白酶活性较低，在周质中表达的重组蛋白质更加稳定。第三，分子伴侣和其他折叠调节因子天然存在于周质中，或可共表达，以协助新合成的蛋白质折叠。这包括伴侣蛋白FkPA、SUrA和SkP以及氧化还原酶（如DsbA、DsbC）,天然存在于大肠杆菌周质中。第四，周质中蛋白质仅占细胞总蛋白质的4%左右，可简化后续纯化过程，降低成本。周质表达的一个常见不足是易位机制可能饱和，这可能对宿主细胞有毒，并降低目的蛋白的最终产量。止匕外，还可以将重组蛋白质以胞外分泌的方式表达，其具有易纯化和降低重组蛋白质空间拥挤等优势。2.7细菌培养条件优化大肠杆菌的培养环境也是影响外源蛋白质可溶性表达的关键因素之一，这些因素包括温度、pH、微量元素等。第一，温度对细菌生长和重组蛋白质表达的影响是多方面的，包括细菌的生长速度、蛋白质合成速度、重组蛋白质折叠前体的聚集倾向程度、蛋白质稳定性和生物活性，以及重组蛋白质的溶解度等。综合效益来看，降低温度往往更有利于重组蛋白质的可溶性表达。因此从培养条件的角度，优化培养温度对提高蛋白质比例影响最大。第二，pH也是影响蛋白质表达形成的因素之一，大肠杆菌生长的最适pH在6.57.5,与外源蛋白质等电点相差越大，所表达的蛋白质就更容易形成可溶性蛋白质。因此需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH,并保持培养基中PH相对稳定。第三，微量元素也能够影响蛋白质的表达形式。研究表明向培养基中加入微量元素(Zn2Mg?+等)可以提高目的蛋白的可溶性表达。这可能是因为异源蛋白质二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量金属离子，能够在一定程度上提高部分酶的活性，进而促进重组蛋白质折叠与稳定性。2.8促溶标签融合表达促溶标签融合表达在增加重组蛋白质产率及提高可溶性表达比例等方面具有重要应用意义。常用促溶标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP),谷胱甘肽S-转移酶(GST)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和硫氧还蛋白(TrX)等(表2)O表2重组蛋白质表达常用融合标签类型融合标签大小W功能特征MRP(MHIlQee-bindingprolein)396防止聚集沉淀帙强促溶N(N-UIiIi11licnxe)495辅助折胜促溶Trx(Tlirv<kxin)109辆助二硫港辄化改善胞内还原性SUMO(Smallubiquitin11wdi11er)约l促溶、辅助折叠特异性蛋白IW识别(UIH)GST(GhiUlhione-S-IransIerase)211促溶表达形成二聚体MBP对重组蛋白质具有较强的增溶效果，是最常用的融合促溶标签之一。在重组蛋白质的N端或C端融合MBP均可有效提高蛋白质溶解度，MBP甚至可以促溶未折叠或错误折叠的重组蛋白质。这种情况下，重组蛋白质在去除MBP后依旧会沉淀，MBP促进重组蛋白质溶解时还能够辅助其折叠。同时MBP还是一种亲和标签，可以与麦芽糖或直链淀粉特异性结合，有助于融合蛋白的粗制纯化。GST是另一种常用的融合促溶标签，对于某些蛋白质，添加GST标签后蛋白质溶解度得到了增强，但有研究表明它是一种较差的溶解度增强剂，原因在于GST自身可形成二聚结构。此外，GST同时也是一种亲和标签，可与偶联GSH配基的层析介质特异性结合，从而一步纯化目的蛋白质。SUMO是一种具有强大促溶功能的融合标签。SUMO可融合于目的蛋白的N端，极大程度提高蛋白质的稳定性和溶解度。SUMo可能是通过发挥分子伴侣作用来促进目的蛋白质折叠。SUMO具有自己的高度特异性蛋白酶(InP),识别SUMO蛋白的三级结构，可将SUMO标签C端残基后(除Pro残基外)的完整蛋白质酶解断裂释放出来，目的蛋白无任何氨基酸序列残留。TrX是一种通用的氧化还原酶，通过硫代二硫键交换还原二硫键。当TrX在大肠杆菌中过度表达时，它的表达量可以积累到高达细胞总蛋白质量的40%仍可溶，因此可作为融合标签在蛋白质表达过程中增加重组蛋白质的可溶性，避免包涵体形成。TrX可以融合到目的蛋白质的N端或C端，将TrX标签置于目的蛋白质N端时更有效。对不同重组蛋白质融合标签的选择需综合考虑。较大促溶标签促溶效果更好，但是其氨基酸组成更加多样，结构也更加复杂，可能对目的蛋白质结构影响较大，同时较大分子量也为宿主细胞带来较大代谢负荷。促溶标签融合位点也很重要，融合于目的蛋白质N端时往往效果更好，因为融合于N端时，在蛋白质翻译过程中促溶标签被首先翻译合成，更有利于促进后续翻译合成蛋白序列的折叠。通过促溶标签融合表达能提高目的蛋白质的可溶性表达比例，促进蛋白质正确折叠，但是融合标签的存在会干扰重组表达蛋白质的生物活性。因此最终绝大多数情况下都需要将融合标签去除，在一定程度上也增加了工艺成本。止匕外，为了简化下游纯化步骤，促溶标签通常与亲和纯化标签(如6xHis-SUMO)融合共表达，可通过最后的标签去除策略，同时去除亲和纯化标签和促溶标签。可以通过在融合标签和目的蛋白质之间插入可被特定蛋白酶识别的氨基酸序列来实现融合标签去除。常用的标签去除蛋白酶包括肠激酶(Asp-Asp-Asp-Asp-LysI)、Ulp-I(SUMO-Glu-Gln-IIe-Gly-GlyI)、HRV3C(Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GlnIGly-Pro)、Xa因子lie-(Glu/Asp)-Gly-ArgI和凝血酶(LeU-VaI-Pro-ArgIGly-Ser)等。2 .9分子伴侣共表达通过分子伴侣协助重组蛋白质折叠提升重组蛋白质可溶性表达的方式主要为将分子伴侣基因协同插入在表达载体上，使其与目的基因共表达，应用中常见的策略有单种分子伴侣过表达和多种伴侣系统协同过表达。细胞中的主要伴侣系统，即热休克蛋白(也称应激蛋白)HSP60(在大肠杆菌中称为GroEL)>HSP70(在大肠杆菌中称为DnaK)、HSP90(在大肠杆菌中称为HPtG)和HSPlOO(在大肠杆菌中称为ClpA和CIPB)家族(数字表示每个HSP亚单位的分子量)是以ATP依赖的方式与聚集蛋白、非天然多肽或标记为降解的蛋白质相互作用。其中，DanK-DanJ-GrpE(KJE)系统和GroEL-GroES(ELS)系统是伴侣分子共表达最常用的两套伴侣分子系统，这两套系统协助/限制蛋白质的从头正确折叠，已在实际应用中被证明单独过表达或与TF触发因子协同过表达，具有增加可溶性蛋白质产量的效果。止匕外，ClpBDnaK具有良好的展开错误折叠蛋白质聚集体的活性，不同于其他大多数伴侣分子依赖于对新生折叠的调节和减少聚集的增溶方式，ClpBDnaK系统提供的分解-再折叠的模式为蛋白质增溶提供了新视角，与其他折叠活性伴侣蛋白系统的共同过量生产很可能具有良好的促溶效果,常用伴侣家族功能及应用见表3有研究者将4种伴侣系统GroEL/GroES(ELS)>DnaKDnaJGrpE(KJE)>CIPB以及大肠杆菌小热休克蛋白IbpA/IbpB(IbPAB)两种或三种搭配用于与重组蛋白质协同过量表达，并通过去除IPTG来抑制蛋白质的生物合成，从而允许折叠伴侣介导的错误折叠和聚集重组蛋白质的重折叠。KJE、CIPB和ELS三种伴侣系统共同搭配相较于没有伴侣共同过量表达的对照组,使部分蛋白质的溶解度提高42倍。虽然分子伴侣的增溶作用具有蛋白质特异性，且分子伴侣表达程度不同时伴侣蛋白的含量是否产生相应变化等过程性问题仍未清晰，但分子伴侣已被成功应用于特定重组蛋白质的辅助折叠与促溶表达研究。表3大肠杆菌表达体系常用分子伴侣分子伸伸家族AJft杆笛修系对应家族功俺应用GvuEL商度海得和时称变构输助幽白康折心GraEXS,typrIjib¼xinf4tv,dM4arGlVESGraES<DHFR>GroEL4；roES(EMaIZamiacnitaM,;5*An*ol<,vuliieacidIgIF)PnaK微少钻蹊折便击白版的聚象并促进蛋IhiaKHuinMnMx4¼gmd9*DmUZGrpK白明水解：根定未折叠撕门康IWlhaK>)rudnnt-TXF-FahtftlwdyIEaKJ加J.<；rpE(ME)GM<SFmiu<CD20IgrWHptG双少播误忻整或未折蛋门坛的*生HCHMUOOCIPA柝分彳有浦次折叠张门版的最柒体ClpACI>HPlK.XMf*3Unt.心PIhPA保护解变性货白质不发生不可逆疑IhPAHMPIIltll柒;给合并Q定变性蛋白质TriggrrUtinrTnQ(rrUr1核解体相关伴TF(MMiranti/orUifDHiirrWilbKLSndarKJE)m)mrinVl,lSpikrPrnlrin<4PEI)V3 .10大肠杆菌N-糖基化修饰重组异源蛋白质在大肠杆菌中难以可溶性表达的主要因素之一在于缺乏翻译后修饰功能，其中糖基化修饰对重组异源蛋白质的稳定性和溶解性具有极大影响。在一定程度上，缺乏糖基化修饰是影响真核蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的最主要因素。因此解决大肠杆菌胞内的糖基化修饰对提高异源蛋白可溶性表达极具重要意义。近年，在大肠杆菌中实现炉糖蛋白生物合成有极大突破。MarkusAebi研究团队将来自空肠弯曲杆菌(C>yosc%er/友汕?，)的pgl基因簇导入到大肠杆菌后，首次实现了利用原核表达系统生物合成N-糖蛋白。其核心之处在于0g/基因簇中包含了合成淤糖链及进行转糖基反应所必需的所有酶类基因，其中的关键酶PgIB同真核生物寡糖基转移酶(OTaSe)亚基STT3在保守区具有高度同源性。PglB酶识别底物蛋白是通过五肽序列Asp/Glu-Xaal-Asn-Xaa2-Ser/Thr(XaaPro),且要求该序列位于暴露程度较高蛋白质表面的柔性区域，因为C.jejuni的小连接糖基化为蛋白质翻译后修饰，糖基化序列如果折叠到蛋白质内部或空间位阻过大就无法被PglB酶所识别,进而难以被糖基化修饰。该团队将源于CjeJ历7，的蛋白质炉连接糖基化修饰系统转移到大肠杆菌中的新技术，为通过原核表达系统制备获取让糖蛋白，提高异源蛋白质在原核表达体系中的可溶性表达开辟了新途径，也开启了大肠杆菌生物合成糖基化蛋白的新篇章。然而，此技术也存在糖基化效率不足、糖基化的糖型结构类型与真核酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统存在显著差异等缺点，限制了其在生物医药领域的应用，但是在大肠杆菌胞内实现异源蛋白质糖基化修饰对非医药方面的应用，如合成生物学领域具有非常重要的潜在价值。因此，提高重组蛋白质在大肠杆菌中的炉糖基化效率和改善糖基化糖型(人源化糖链类型降低免疫原性)将成为未来研究的热点。3 、其他促溶策略除了以上传统促溶策略之外，研究人员也开发了多种其他能够改善重组蛋白质可溶性的方法。S0rensen等81提出了一种基于大肠杆菌核糖体的体内拯救系统，将异源目的蛋白质与位于50S核糖体亚基上的核糖体蛋白L23(rpL23)相融合，中间插入一个编码FXa内肽酶识别位点，然后在rpL23缺陷的大肠杆菌菌株中表达。通过酶解方式将重组异源蛋白质从核糖体中断裂下来，然后纯化获得重组异源目的蛋白质。使用这一方法最终成功将5种不同异源蛋白质成功可溶性表达，包括绿色荧光蛋白(GFP)、链霉亲和素(SA)、小鼠白细胞介素-6(mIL-6)酵母延伸因子(yEFlA)和单链抗体(SCFV),其中4种在大肠杆菌细胞质中均表达为不溶包涵体。DragOSitS等报道了一种合成生物学方法使重组蛋白质能够自我表达调节。一旦检测到细胞的应激信号，细胞就能够负反馈自行关闭重组蛋白质的生产。在pET表达系统和大肠杆菌C41(DE3)菌株中，DE3在IaC启动子的控制下编码T7聚合酶，进而转录重组基因。用一个含有抑制蛋白TetR结合位点调控pET23b(+)载体表达重组蛋白质，在第二个质粒(PNFjretR)上利用热休克蛋白IbpA/IbPB启动子(PlbPAB)来调控表达TetR,以此来实现应激联动调控重组异源蛋白质的表达。以易于形成包涵体的GFP突变体作为模型重组蛋白质，成功将其可溶性表达的比例大幅度提高。4 、未来展望重组蛋白质生产在学术和工业领域具有重要意义。大肠杆菌表达系统由于其生长迅速、培养成本低廉，并且表达外源重组蛋白质水平在极短时间内可富集(最高可达总蛋白质量的40%50%),在异源重组蛋白质表达中使用非常广泛。蛋白质错误折叠或未折叠以及形成包涵体是大肠杆菌表达体系应用的巨大阻碍。因此，探索可溶性表达策略对应用大肠杆菌体系生产重组蛋白质意义重大。重组蛋白质自身的氨基酸组成、亲疏水性强弱、分子量大小、结构复杂程度、结构折叠难易程度、二硫键形成与否、二硫键数量及重组蛋白质的合成速度等均能影响重组蛋白质在大肠杆菌表达体系中的表达形式和可溶性表达比例。因此，在大肠杆菌表达体系中实现更多重组异源蛋白质的可溶性与功能性表达仍然有诸多挑战，未来还将从以下几个方面持续改进:其一，不断完善重组异源蛋白质在胞内的结构折叠辅助体系，包括分子伴侣、融合伴侣等的设计与开发；其二，进一步优化提高在原核宿主系统中的二硫键氧化与正确形成能力；其三，持续改善大肠杆菌表达体系的糖基化能力和形式，包括糖基化效率和糖基化糖型优化等。本文综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因和机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素，并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤，总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略，旨在为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。