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植物生物化学与分子生物学植物基因工程,课程概要一、引言二、基因工程操作的主要实验技术及其原理三、基因工程的主要原理过程 1、目的基因的获得（9种基因克隆策略）2、重组体的构建、转化,3、重组体克隆的筛选、鉴定（蓝白筛选等）4、植物转基因工程 4.1、外植体的选择及培养 4.2、植物的转基因方法及原理 4.3、转基因植物的筛选及鉴定 4.4、转基因植物的田间移植、鉴定、推广 四、植物基因工程研究进展 抗虫、抗病、抗非生物胁迫、品质改良、植物医药工程等 五、转基因植物的安全,第二讲二、基因工程操作的主要实验技术及其原理,1、核酸的分子杂交 2、凝胶电泳技术 3、核酸的酶切、连接 4、质粒的提取 5、细菌转化 6、植物转基因技术 7、密度梯度离心 8、DNA的序列测定、结构分析 9、基因的人工合成,1、核酸的分子杂交技术 1.1 概念：互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合 双链DNA分子的过程。1.2 原理：序列同源性或抗原抗体反应。1.3 特点：高度的灵敏度和高度的特异性。,1.4 主要分类：1.4.1、按照支持介质分为：膜上杂交、原位杂交、液相杂交 1.4.2、按照分子类别分为：DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA，抗原-抗体 1.5 应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、特定基因序列的定性及定量检测、特定基因在生物体内分布的准确位置、疾病的诊断等方面。,1.6 要检测特定基因需要的必备条件：1.6.1、要有已知核苷酸序列的片段探针或抗体 1.6.2、简单可靠的探针标记方法 1.6.3、敏感性高且特异性强的检测方法,1.7 杂交涉及的主要内容及技术方法 1.7.1 膜的种类及特性 类型 优点 缺点 硝酸纤维素膜 结合ssDNA、RNA和蛋白质的 易碎、易皱褶，再使用 能力为 80-100ug/cm2,价廉，能力有限，结合小片段 可用于微量制备 DNA的能力有限，不能同 DNA共价结合 DEAE滤纸 结合ssDNA和RNA的能力 结合DNA、RNA的能力有限 为 15ug/cm2 易碎 Nylon膜 结合DNA、RNA、蛋白质，敏感性高 有些类型会出现较高本底 柔性好，可重复利用，不需要预浸湿,1.7.2 常用标记物的种类 放射性标记物 非放射性标记物 生物素类 酶类 半抗原 荧光素 其他 3H 生物素 碱性磷酸酶 地高辛配基 异硫氰酸荧光素 汞离子 14C 光敏生物素 辣根过氧化物酶 羟基香豆素 AAF 32P 金、银 125I 35S,1.7.3 常用放射性标记物及其特性,1.7.4 地高辛标 记及检测 原理,1.7.5 常用核酸探针标记方法 A、双链DNA探针及其标记方法 1.切口平移法(nick translation)2.随机引物合成法 B、单链DNA探针 1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 2.从RNA合成单链cDNA探针 C、末端标记DNA探针 D、寡核苷酸探针 E、RNA探针,双链DNA探针及其标记方法（看movie，光盘第 17：02分）,1.7.6 转膜过程示意图,1.8 几种常见的杂交 1.8.1 Southern杂交 1.7.1.1 DNA的提取 1.7.1.2 纯度鉴定 OD260 OD280 OD230,1.8.1.3 DNA的酶切 1.8.1.4 电泳、转膜、杂交,1.8.2 Northern杂交 1.8.2.1、RNA的提取 提取注意事项:药品、器具、操作 不同提取方法比较：针对特定材料的最佳方法 1.8.2.2 纯度鉴定 OD260 OD280 OD230,1.8.2.3 甲醛变性胶电泳、转膜、杂交 12h 36h 72h 96h,1.8.3 噬菌斑原位杂交(文库筛选）,1.8.4 组织原位杂交,课后思考题：1、核酸探针的标记方法有哪些？2、RNA提取需要注意哪些因素？3、要获得好的杂交结果，需注意哪些因素？4、核酸分子杂交主要应用在哪些方面？具有 何重要性？5、查找2005年的含有分子杂交的SCI文章并翻译。预习：第三讲 植物基因克隆的主要策略,
