生物化学基础.ppt

氢键到处存在,DNA 分子,肽链间,氢键的类型,1838年 Muller研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后,发现它 们均可以用C40H62N10O12 来表示,命名为Protein(意为to take the first place),并发展成 基团 学说 19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸,基团学说消声匿迹1902年 Fischer,Hofmeister同时提出肽键理论,蛋白质化学研究史,1924年 Svedberg 发明超离心机1930年代 Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽1950年 Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：-螺旋和-折叠1953年 Sanger确定了牛胰岛素的一级结构1958年 Perutz&Kendrew用X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构1961年 Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其立体结构1980年代 蛋白质工程的兴起1997年 蛋白组研究的概念1999年 蛋白质芯片技术出现,1.酶类,占细胞内蛋白质种类的绝大部分2.运输蛋白,如albumin,hemoglobin,transferrin等3.收缩运动蛋白,如actin,myosin,tubolin等4.激素蛋白,如insulin,growth hormone等5.细胞分裂素(cytokinin),如EGF,PDGF,IL-2等6.受体蛋白,如insulin receptor,rhodopsin等7.毒素蛋白,如cholera toxin,ricin,pertussis t.8.营养贮藏蛋白,如prolamine,glutelin等9.防御蛋白,如IgG等10.结构蛋白,氨基酸的名称与符号,alanine 丙氨酸 Ala Aarginine 精氨酸 Arg Rasparagine 天冬酰氨 Asn Naspartic acid天冬氨酸Asp Dcystine半胱氨酸CysCglutarmine 谷氨酰胺 Gln Qglutarmic acid谷氨酸 Glu Eglycine甘氨酸GlyGhistidine组氨酸HisH,isoleucine异亮氨酸IleILeucine 亮氨酸LeuLlysine赖氨酸LysKmethionine甲硫氨酸MetMphenylalanine苯丙氨酸PheFproline脯氨酸ProPserine丝氨酸SerSthreonine苏氨酸ThrTtryptophan色氨酸TrpWtyrosine 酪氨酸TyrYvaline缬氨酸ValV,修饰型氨基酸,胶原蛋白,结缔组织,无色晶体，熔点较高（200300），水中溶解度各不同，取决于侧链。在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe,利用这一特点，可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。,氨基酸的理化性质,同一个氨基酸分子上可以即有正电荷又有负电荷，故称为两性电解质(ampholytes)。在水溶液中，氨基和羧基在不同的pH条件下表现出不同的解离状态，在特点的pH条件下会呈电荷中性，这时的pH称为等电点（isoelectric point),以符号pI 来表示。,850左右分解 与茚三酮(ninhydrin)的反应 定量反应 与亚硝酸的反应 Van Slyke定氮 与2,4-二硝基氟苯(FDNB)的反应 测序 与二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)的反应 测序 与荧光胺的反应 微量检测 与Edman试剂(苯异硫氢酸)和 测序 有色Edman试剂的反应与肼(hydrazine)的反应 C端氨基酸分析,氨基酸的化学性质,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:primary structure 一级结构：氨基酸序列secondary structure 二级结构：螺旋，折叠tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构：蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。,蛋白质一级结构测定的步骤,1、蛋白质的分离纯化 Purification2、二硫键的拆分与保护 S-S cleavage&blocking3、(亚基分离）Subunit separation4、多种方法的部分水解 Partial h.5、分离水解后得到的多肽 Peptide s.6、测序 Sequencing7、重叠 Overlapping,N末端和C末端测序法,N末端：1、Sanger法2、Edman法3、Dansyl chloride/Edman组合法4、酶降解法C末端：1、肼法2、3H标记法3、酶降解法 4、PFPA/PFPAA法,Edman 降解法,苯异硫氰酸,维持蛋白质空间构象的作用力,作用力 破坏因子氢键：-螺旋，-折叠 尿素，盐酸胍疏水作用：形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂Van der Waals力：稳定紧密堆积的集团和原子离子键：稳定-螺旋，三、四级结构 酸、碱二硫键：稳定三、四级结构 还原剂配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA,肽链中的肽平面,螺旋特性,氢键取向与主轴基本平行,右旋，3.6个氨基酸一个周期，螺距0.54 nm,第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。,转角半圈3.010 螺旋,超二级结构的类型,：螺旋的侧链位置的20度错位.e.g.keratin,myosin,、：伸展肽链的12.5度自然扭曲.e.g.拥有-sheet的蛋白质,结构域(domain)在空间上相对独立,免疫球蛋白,蛋白质的Folding,蛋白质从伸展的多肽链形成其特定的立体结构的过程叫折叠（folding）。维持其特定的立体结构的作用力为：氢键、疏水作用、范德华力、离子键和配位键。,有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形成自由能最低的立体结构，而需要一类蛋白质来催化，这类蛋白质称为分子伴侣（molecular chaperone）。它们普遍存在于真核生物和原核生物中，一般使用ATP的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的立体结构，但不改变自己。,蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。Anfinsen 实验证明了蛋白质的一级结构决定其高级结构。,蛋白质的理化性质,蛋白质溶液是一种胶体溶液；特定的空间构象，分子量一定 分子筛层析；在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷 等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域 有机溶剂沉淀，疏水层析；,蛋白质变性概念因素理化变化生物学变化变构效应反馈抑制,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐 析,盐溶,几种常用的电泳,等电聚焦纸电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳OFarrell的双向电泳,几种常用的层析,分子筛层析离子交换层析亲和层析 疏水/反相层析物理吸附层析,初提 精纯化盐析 离子交换层析有机溶剂沉淀 分子筛层析等电点沉淀 疏水/反相层析 结晶 亲和层析,蛋白质分离纯化的具体方法,蛋白质分子量的确定方法,超离心法:M=RTs/(1-)D 凝胶过滤:v=k+clogMSDSPAGE法:d=k+clogM光散射法:M=/Hc渗透压法:M=cRT/,蛋白质的定量法,克氏(Kjeldahl)定氮法:浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3双缩脲(biuret)法:CuSO4与肽链的氨基结合Folin-Phenol法:芳香族氨基酸侧链发色紫外法:280纳米处的紫外吸收(1 OD280=1 mg/ml)Bradford法:考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化,核酸化学,RNA：ribonucleic acid 核糖核酸DNA：deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸pyrimidine：cytosine(Cyt)胞嘧啶 嘧啶 thymine(Thy)胸腺嘧啶 uracil(Ura)尿嘧啶purine：adenine(Ade)腺嘌啉 嘌啉 guanine(Gua)鸟嘌啉,ribonucleside 核糖核苷（不带磷酸）adenosine(Ado)腺(嘌啉核)苷 guanosine(Guo)鸟(嘌啉核)苷 cytidine(Cyd)胞(嘧啶核)苷 thymidine(Thd)胸(腺嘧啶脱氧核)苷 uridine(Urd)尿(嘧啶核)苷ribonucletide 核糖核苷酸（带磷酸）adenosine 5-mono(di,tri)phosphaste；AMP,ADP,ATPdeoxyribonucleoside 脱氧核糖核苷 deoxyadenosine(dAdo)deoxyribonucleotide 脱氧核糖核苷酸 dAMP,dADP,dATPdNTP,Nucleotides,A variety of roles in cellular metabolism:the building blocks of RNA and DNA;the energy currency;the essential chemistry links(response of cell);the structural components(enzyme cofactor,metabolic intermediates),DNA中的四种碱基及它们间的氢键,胞嘧啶,胸腺嘧啶,鸟嘌啉,腺嘌啉,T,C,A,G,DNA的水解产物中有碱基、磷酸、脱氧核糖、核苷、核苷酸等，因而推测DNA的骨架结构为,DNA的骨架结构,RNA分子与DNA分子的区别只在一个羟基，T vs U，但就这点区别，RNA分子的化学性质比DNA活泼得多。,RNA的骨架结构,Watson-Crick的DNA双螺旋,2.0 nm,结构特征,双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直,稳定双螺旋结构的作用力为氢键和碱基堆积力（即疏水作用）,碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。,核酸的结构层次,核酸的一级结构：碱基的排列顺序DNA 5-ATGCATGC3 3-TACGTACG3RNA 5-AUGCAUGC3核酸的二级结构：形成双螺旋的部分核酸的三级结构：空间构象,细菌质粒DNA的不同状态,松弛型,超螺旋,部分解链,DNA的序列测定ddNTP法,Sanger法,DNA与限制性内切酶,双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断,又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。,DNA分子的变性,1.37倍,增色效应,1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g,不同来源DNA的变性曲线,盐浓度对DNA变性的影响,DNA分子的Tm与GC含量有关,DNA的变性与分子杂交技术,1.RNA分子在糖基上比DNA分子多一个OH基，位于2位。A260nm/A280nm=2.0,而DNA为1.8。RNA分子遇碱极易降解，而DNA则不。2.RNA分子一般为单链分子，因此容易形成自由能为最小的独特的二级结构,其双链部分符合Watson-Click双螺旋模型。3.正因为独特的二级结构和多余的2羟基的存在，一些 RNA分子具有自我切断、自我连接，或切断其他核酸分子、连接其他核酸分子的活性，第一个可以自我复制的分子被认为是RNA分子。,RNA分子,4.RNA分子可以通过由蛋白质酶催化的反应转化为DNA分子(Ribonucleoside diphosphate reductase)。5.RNA分子在细胞中同时扮演着信息的媒介作用和执行者的作用，mRNA为前者，rRNA、tRNA和snRNA为后者。因此很自然的认为生命的早期可以称为RNA world。6.RNA分子比DNA分子更容易受到修饰，均有其用途(作用)，如mRNA的5帽子能启动蛋白质的翻译，tRNA上的修饰可以增加tRNA的寿命。7.真核细胞的基因拥有令人吃惊的特点，顺序中插入了很多不编码氨基酸的废物（Introvening sequence,或叫内含子），这些序列得到转录后在mRNA成熟之前被除去。,RNA的功能,1.遗传密码的中间担体(mRNA)2.mRNA剪接等加工的活性成份(snRNA)3.核糖体的骨架结构及与mRNA的识别(rRNA)4.活化氨基酸的担体(tRNA)*5.酶的活性成份*6.病毒基因组的担体,原核生物的基因结构,启动子,转录起始,结构基因1,结构基因1,结构基因1,转录终止子,转录终止,DNA,真核生物的基因结构,启动子,外显子,内含子,转录终止子,真核生物mRNA的5端和3端,RNA的加工类型,1.Cleavage2.Trimming3.Splicing4.Editing5.Modification,全酶(holoenzyme)|酶蛋白（apoenzyme)+辅助因子（cofactor)cofactor,酶的结构概念,辅基，prosthetic group,辅酶，co-enzyme,金属离子,结合力强,EC号的第一个数字1.oxidoreductase 氧化还原酶类2.transferase 转移酶类3.hydrolase 水解酶类4.lyase 裂合酶类5.isomerase 异构酶类6.ligase/synthetase 连接酶类,酶的命名法,氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂合酶,异构酶,连接酶,竞争性抑制(Competitive inhibition):E+S ES E+P+I Ki EI反竞争性抑制(Uncompetitive inhibition):E+S ES E+P+I Ki ESI,酶反应的三种不同抑制,Ki=E*I/EI,Eo=E+EI+ES,Eo=E+ESI+ES,非竞争抑制(Noncompetitive inhibition):E+S ES E+P+I Ki+I Ki EI ESI,不同类型抑制作用的米氏方程,I,竞争性抑制,反竞争性抑制,非竞争性抑制,酶经常以多(寡)聚体的形式存在很多酶都有同工酶,可以聚合在一起,也可以单体存在多亚基酶往往受正协同别构效应的调控核酶：RNA可以是酶,或酶活性的主要成分抗体酶：抗体也可以成为酶,酶反应的机制及相应理论和假说酶活性的调控:别构效应酶的作用机理影响酶活力的因素,激素(Hormone),1904，Bayliss W.和Starling E.提出激素概念，激素一词源于希腊语horman,意指to stir up or excite。生物体内特殊组织或腺体产生、直接分泌到体液中（动物指血液、淋巴液、脑脊液、肠液），通过体液运送到特定作用部位（靶），引起特殊激素效应的一群微量的有机化合物。是生物体内的“化学信使”。1855年，生理学家Claude Bernard用“内分泌”一词以区别“外分泌”。,神经与内分泌,哺乳动物各器官间代谢的协调靠激素和神经信号来完成，组织中的个别细胞感受环境变化并通过分泌胞外化学信号作出反应。内分泌细胞分泌激素，神经细胞释放神经递质。激素可以在很远的器官和组织间通过血液很快传递，在作用到靶细胞前可传导1米或更远；神经信号可能仅在反应链中通过突触间隙传到下一个神经元，可能只传递几毫米分之一。,激素的分类,激素按化学本质可分为三大类：含氮激素（包括蛋白质激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素）固（甾）醇类激素脂肪酸衍生物激素（二十碳四烯酸）,激素的作用方式,激素在血液中存在时间短，不需要时会在酶的作用下钝化。有些激素产生瞬时生理或生化反应，如肾上腺素；而有些激素如性激素需数小时或数天才对其靶组织产生作用。通常快速作用的激素通过变构作用或共价修饰一个或多个预选存在的酶而改变酶的活性；慢作用的激素通常通过改变基因的表达，引起一些调控蛋白的生物合成。所有激素都是通过与对激素敏感的靶细胞表面存在的特异受体结合发挥作用，结合是高特异高亲和的。,水溶性激素的作用机理,水溶性激素（肽类和胺类激素）不能通过细胞膜，它们的受体位于靶细胞的外表面，激素与膜上的特异受体结合，受体产生变构作用，改变酶的构象，或产生或引起胞内信号分子的形成。这种胞内信号分子被称为第二信使（the second messenger），如cAMP，或调控特异的酶反应，或改变一个特异的或一套特异基因翻译形成蛋白质的速度。,脂溶性（类固醇）激素的作用机理,类固醇激素和甲状腺激素作用中，激素-受体复合物自身携带信使，改变基因表达。由于脂溶性激素可通过细胞膜，它们或与膜上受体结合进入细胞、或进入细胞后与核膜上受体结合，两种情况都进入核内，调控特异基因的表达。,人体主要内分泌腺,激素在复杂阶层上发挥作用,人体内分泌系统及激素的分泌和作用存在一个复杂的作用及调控层次，外界刺激（包括一些体内信号）作用于中枢神经系统；中枢神经的神经冲动作用于下一个层次下丘脑或肾上腺髓质；下丘脑或分泌下丘脑激素（释放因子）作用于垂体前叶分泌各种促激素，或直接作用于垂体后叶分泌催产素和加压素；垂体前叶分泌的各种促激素作用于各腺体分泌激素，进而作用于各自的靶组织。,激素通过cAMP起作用,级联式放大作用,Ca2+在许多信号传导中起第二信使作用,在对激素敏感的细胞中，神经元、肌细胞及许多对胞外信号起反应的细胞中，Ca2+作为第二信使激发胞内的反应。Ca2+激发的过程有神经和内分泌细胞的胞吐作用及肌肉的收缩。Ca2+激发细胞反应的一种方法是激活各种依赖Ca2+的酶，包括一种蛋白激酶Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase，酶结合亚基是Ca2+结合蛋白钙调蛋白。,生物膜和运输（Biological Membrane and Transport）,生物膜的形成对于生物能量的贮存及细胞间的通讯起着中心作用。膜的生物活性来自于膜自身显著的特性：膜连接紧密但有弹性；膜自我封闭，对极性分子有选择性通透；膜的弹性允许膜在细胞生长和运动中改变形状；暂时破裂且可自封闭的能力可保证两个细胞或两个膜状包裹物的融合。,膜的生化特性,膜不仅仅是被动的屏障，膜上含有一系列的特化蛋白质启动或催化一定的分子事件；膜上的泵可以逆跨膜梯度移动（运送）特定的有机物和无机离子；能量转化器可以把一种形式的能量转化为另一种形式的能量；质膜上的受体能够感受胞外信号，并转化为细胞内的分子事件。,膜的分子组成,生物膜几乎所有的质量都由蛋白质和极性脂质组成，少量的碳水化合物也是糖蛋白或糖脂的一部分。蛋白质和脂类的相对比例因不同的膜而不同，反映着膜生物作用的广泛性。神经元的髓鞘主要由脂类构成，表现为一种被动的电子绝缘体；但细菌、线粒体、叶绿体的膜上由许多酶催化的代谢过程发生，含有的蛋白比脂类要多。,每种膜都有一个特征的脂质组成,各种来源的膜的化学分析显示了一个共同的特征，即膜脂组成因不同的界、不同的种、不同的组织、特定细胞中不同的细胞器而不同。细胞有一种清楚的机制，可以精确控制膜脂合成的种类和数量，以及定位到特定的细胞器上。,不同功能的膜含有不同的蛋白质,不同来源膜的蛋白质组成比其脂质组成的变化更大，反映在膜功能的特化上。脊椎动物视网膜杆状细胞对于接受光为高度特化，90%以上的膜蛋白是光吸收蛋白视紫红质；特化较低的红细胞质膜约含20种显著的蛋白及十几种较少的蛋白，其中多数的蛋白为运输载体，每一种蛋白运输一种跨膜的溶质等。有些膜蛋白还有一个或多个脂共价结合，后者可能形成一种疏水的稳定体系以保证蛋白质存在于膜中。,流动镶嵌模型（Fluid Mosaic Model）,生物膜中兼性的磷脂和固醇形成一个脂质双分子层，非极性部分相对构成双分子层的核心，极性的头部朝外；脂质双分子层结构中，球状蛋白以非正规间隔埋于其中；另一些蛋白则伸出（突出）膜的一面或另一面；还有一些蛋白跨越整个膜。蛋白质在脂双分子层中的方向是不对称的，表现为膜蛋白功能的不对称。脂质与蛋白质之间构成一个流动的镶嵌结构。,膜脂在不断地流动,虽然脂双层结构的本身是稳定的，但单个的磷脂和固醇可在脂质平面内有很大的运动自由，它们的横向运动很快，几秒之内单个脂分子就可环绕红细胞的一周。双分子的内部也是流动的，脂肪酸的碳氢链可通过碳碳旋转而不断地运动。另外一种运动就是跨双分子层运动，即flip-flop。膜流动的程度以来于脂的组成及温度，低温下的运动相对较少，脂双分子层几乎呈晶态（类晶体、半晶体）排列；温度升到一定高度时，运动增加，膜由晶态向液态转变。,膜脂的运动,温度引起侧链热运动,脂双层平面的扩散,跨膜扩散：“翻跟头”,冰冻蚀刻（Freeze-fracture Technique)撕开膜双层,膜内（嵌入）蛋白与脂通过疏水作用维系在膜中,嵌入蛋白通常富含疏水氨基酸区域（可在中间段，也可在氨基端或羧基端），有些可有多个疏水序列，如-螺旋，可横贯整个膜脂双分子层。,膜蛋白是不对称的,糖蛋白分布的不对称反映了功能的不对称；许多膜蛋白在双分子层上有一定的取向，很少发生翻转的情况，及时有，flip-flop也非常慢。蛋白质分布的不对称往往还与组成膜上的泵相关。,膜融合事件,两个膜融合需要：相互识别；相互表面靠近并相对（排除水分子）；双层结构部分破坏；两个双分子层融合为一个连续的脂双分子层。受体调节的内吞或控制的分泌还需要融合发生在合适的时间或者是对特异信号的反应。融合蛋白（嵌入蛋白）（fusion protein）参与以上融合事件，引起特异识别和短暂、局部脂双层结构变形促使膜融合。融合蛋白可搭起两个膜融合的桥，并带来融合区域脂双分子层的暂时恢复。膜联蛋白（annexin）（一种Ca2+活化后可与膜磷脂结合的蛋白）是一类紧挨质膜的蛋白质，需要Ca2+，与脂双分子层的磷脂结合，可通过交叉连接两个不同膜的脂质分子。,跨膜运输,所有生物细胞都要从环境获得原材料为其生物合成和能量消耗，同时还需释放其代谢物到环境中去。质膜可以识别并允许细胞所需物如糖、氨基酸、无机离子等进入细胞，有时这些成分进入细胞是逆浓度梯度的，即它们是被“泵”入细胞的，同样一些分子是被“泵”出细胞的。很少有例外小分子物质的跨膜是直接通过蛋白的，而是通过跨膜的通道（channels）、载体(carriers)或泵（pumps）。,被动运输是由膜蛋白促进的顺浓度梯度的扩散,生物体内的简单扩散因膜把胞内和胞外环境所阻止，膜是一种选择性通透屏障，要通过脂双分子层，极性分子或带电溶质必需解除水化膜的水的作用，然后透过约3nm 的介质（膜）。水是一种例外，可很快透过生物膜，机制尚不清楚，膜两侧溶质浓度差异大时，渗透压的不平衡引起膜两侧水的流动，直至两侧的渗透压相等。极性溶质或离子的过膜运输由膜上的蛋白降低活化能而对特异的物质提供过膜路径而过膜的双分子层，引起促进扩散。,主动运输（Active Transport）引起物质的逆浓度梯度运输,被动运输总是顺浓度梯度运输，不会引起物质的积累，相反，主动运输总是逆浓度梯度运输，引起物质的积累。主动运输直接或间接地依赖于一些放能过程，非热力学自动发生，往往伴随有光的吸收、氧化作用、ATP水解或其他顺浓度梯度的运输。在初级主动运输中，物质的积累直接与放能反应（如ATPADP+Pi）相连接；次级主动运输发生于由初级主动运输引起的逆浓度积累的顺浓度梯度运输。,生物氧化（Biological Oxidation）,生物氧化的概念,相当于分解（异化）作用。生物氧化是指糖类、脂类和蛋白质等在生物活细胞内进行的一系列的氧化分解作用，最终生成H2O和CO2,同时释放能量的过程，又称细胞呼吸或组织呼吸。,生物氧化发生的场所,1948年，Eugene Kennedy和Albert Lehninger发现，线粒体是真核生物氧化磷酸化的场所，开始了生物能传导的新世代。线粒体有两层膜结构，外膜对小分子（Mr5000）和离子为自由透过（通过跨膜通道）。内膜对大多数小分子及离子不透过（包括H+），只有内膜上存在特异运输体的物质可以透过。内膜上含有呼吸链和ATP合成酶。线粒体基质含有丙酮酸脱氢酶复合物和柠檬酸循环途径、脂肪酸-氧化途径、氨基酸氧化途径及酵解以外所有能量物质氧化途径。,生物氧化体系呼吸链(respiratory chain),生物氧化体系解决的是有机物脱氢及氢的去路问题，即解决有机物是如何通过一系列特异性的酶催化的反应脱氢、递氢和递电子，把氢交给氧生成水，并产生ATP的问题。整个氢的传递和电子的传递过程以及参与这一系列催化反应的酶与辅酶及其他中间递体一个接一个，组成链状反应体系，如同接力棒一样，这种形式的反应呼吸链。递氢体：呼吸链中参与传递H的辅酶或辅基递电子体：呼吸链中参与传递电子的辅酶或辅基,人体组织最普遍最重要的呼吸链,以NAD+(CoI)或NADP+(CoII)为辅酶的脱氢酶黄素蛋白（黄酶，yellow enzyme,flavoprotein,FP）辅酶Q(CoQ,泛醌，ubiquinone)细胞色素复合物(cytochrome complex)组成两条呼吸链：S.NAD+FP1 CoQ bc1c(a+a3)1/2O2 FP2 S.,呼吸链的组成及作用机理,(1)烟酰胺脱氢酶类（nicotinamide dehydrogenases)(或称吡啶脱氢酶类，pyridine dehydrogenases)(2)黄素酶类（flavoprotein,flavinlinked dehydrogenase,NADH dehydrogenase)黄素单核苷酸（FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)(3)辅酶Q(coenzyme Q,CoQ)(泛醌 ubiquinone)(4)细胞色素类（cytochromes)Cytb,Cytc,Cytc1,Cyta1a3,人体重要的呼吸链,NADH 氧化呼吸链（由CoI、Flavoprotein、Iron-sulfur protein、CoQ、Cytochrome complex组成)琥珀酸(succinate)氧化呼吸链（由Succinate dHE、CoQ及Cyt复合物组成,呼吸链中ATP的产生,穿梭系统（Shuttle Systems),有些NADH是在胞液中产生的，而呼吸链位于线粒体的内膜上，线粒体的内膜对NADH不能透过，必须通过一定的转运机制才能保证底物分子脱下的H可以通过呼吸链递氢和递电子被彻底氧化，释放能量。这种转运机制即为穿梭系统，经过穿梭系统把胞液中的NADH转变为线粒体内的NADH经呼吸链被氧化。包括磷酸甘油穿梭、苹果酸-草酰乙酸穿梭。,底物水平磷酸化（Substrate Level Phosphorylation),代谢物质分解过程中，底物分子因脱氢、脱水等作用，能量在分子内部重排（重新分布）形成高能磷酸酯键，并转移给ADP形成ATP。,氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation),生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化为水时所释放的能量转移给ADP形成ATP的过程。实际上是氧化作用与氧化作用过程释放的能量用于形成ATP过程（磷酸化作用）两种作用的偶联反应。,磷氧比（P/O）,代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水，一对电子经呼吸链传递到O2生成水所产生的ATP分子的数目（即消耗1分子O2所产生ATP的数目）称为磷氧比（P/O）。代谢物脱下的2H经NADH氧化呼吸链被氧化为水时，生成3ATP（P/O3），而经琥珀酸氧化呼吸链氧化为水时，生成2ATP（P/O2）。新近的研究结果支持这样的结论，2H经NADH氧化呼吸链被氧化为水时，生成2.5ATP；而经琥珀酸氧化呼吸链氧化为水时，生成1.5ATP。,化学渗透假说(Chemiosmotic Hypothesis),1961,Peter Mitchell（1920-1992）（英生化学家）提出，因此获得1978年诺贝尔奖。电子传递的结果把H+从线粒体内膜基质泵到膜外空间，形成一个跨线粒体内膜的H+梯度，其中所含的化学渗透能正是促进ATP合成所需能量，这种能量被称为质子推动力或质力(Proton-motive force)。,化学渗透模型（Chemiosmotic Model),ATP合成酶及ATP合成,糖代谢(Carbohydrate Metabolism),第阶段，有机物分解为它们的组成前体物质。第阶段，小的燃料分子分解为几种常见的中间物，主要是丙酮酸和乙酰-CoA，可放出少量能量。第阶段，有一条途径组成，即Krebs循环，又叫柠檬酸循环或三羧酸(TCA)循环。中间物被完全氧化成CO2，生成的电子传递给NAD+并释放少量能量，其中的中间物又可作为生物合成的原料。第阶段，包括电子传递和氧化磷酸化，电子传递给O2，H2O生成，释放的大量能量用于ATP的生成。,糖酵解（Glycolysis）与发酵（Fermentation）,无氧条件下糖的降解过程，糖经一系列的酶促反应变成丙酮酸，并生成ATP，是一切生物细胞中Glc分解产生能量的共同代谢途径，也称Glycolytic pathway，或Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)pathway。厌氧生物（酵母及其他微生物）把酵解中生成的NADH+H+用于还原丙酮酸生成乙醛，进而产生乙醇，称为乙醇（酒精）发酵。肌肉等组织或微生物在无氧或暂时缺氧条件下，酵解中生成的NADH+H+用于把丙酮酸乳酸，称为乳酸发酵。,碳水化合物进入酵解途径的前奏,除葡萄糖以外，其他碳水化合物通过酵解进入分解代谢，必须首先转变为酵解途径的任一中间物。最重要的是贮存多糖（淀粉和糖元）、二糖（麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖）及单糖（果糖、甘露糖、半乳糖）。糖元和淀粉通过相应的磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶生成G-6-P进入酵解。其他单糖可形成多个分支点的中间屋进入酵解。,糖酵解,糖酵解,EMP的能量消耗与生成,丙酮酸的代谢命运,1）无氧条件下，丙酮酸转变为乳酸。2）无氧条件下，丙酮酸转变为乙醛，进而生成乙醇。3）有氧条件下，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA，进入三羧酸循环，氧化供能（乙酰-CoA在能量状态高的情况下可用于合成脂类物质）。4)丙酮酸作为其他物质合成的前体（如Ala）。,NADH+H+的命运,无氧条件下:通过乙醇发酵受氢，解决重氧化 通过乳酸发酵受氢，解决重氧化有氧条件下:通过呼吸链递氢，最终生成H2O,并生成ATP。,酵解途径,EMP的说明,1）己糖激酶(hexokinase)需要Mg2+或其他二价阳离子及ATP供能，反应不可逆，是酵解过程的第一个调节（别构）酶，肌肉中受产物G-6-P强烈别构抑制。肝脏中主要是以glucokinase存在，对Glc有特异活性，不受G-6-P的抑制。2）果糖磷酸激酶（phosphofructokinase），需要Mg2+及ATP，是酵解途径的关键反应(committed step,key reaction,rate-limiting reaction)酶，酵解进行的速度取决于该酶的活性，酶的调节也是别构调节，ATP对其有抑制效应，柠檬酸及脂肪酸的存在会加强ATP的抑制作用，AMP、ADP及Pi可消除抑制。,EMP的说明（续）,3）3-P-甘油醛dHE(phosphoglyceraldehyde dHE)活性中心在酶的Cys-SH上，NAD+与酶紧密结合，受氢还原后与酶脱离，磷酸攻击硫酯键生成1，3-二磷酸甘油酸。只有NAD+不断取代NADH才能保持酶的催化活力，否则酵解就要停止。ICH2COOH与-SH反应，可强烈抑制酶的活性。4）烯醇（化）酶（enolase）有Mg2+或Mn2+存在时，酶才有活性，F-能与Mg2+形成络合物并结合在酶上而抑制酶的活性。5）丙酮酸激酶（pyruvate kinase）别构调节酶，需要Mg2+，K+，催化的反应有ATP生成，是酵解途径的重要调节酶，长链脂肪酸、乙酰CoA、ATP、Ala等均抑制酶活；F-1,6-diP可活化此酶。6）整个酵解途径的反应1、3、10为严格不可逆。,EMP总结,1)无氧条件下，Glc分解为乙醇或乳酸，为无氧分解 2).酵母等，Glc2 ethanol+2CO2 肌肉等，Glc2 lactate 3).虽无O2参与，但有脱氢反应，H的受体为NAD+，细胞内NAD少，必需解决NADH的重氧化。4).两种发酵均净生成2ATP，且均为底物水平磷酸化。5).某些反应需要辅酶或辅助因子，如NAD+,TPP,Mg2+,K+等。,丙酮酸激酶的调节作用,F-6-P对果糖磷酸激酶的变构调节作用,磷酸果糖激酶-1的活力,大肠杆菌PFK四亚基中的两个,果糖1,6-二磷酸,ADP,F-6-P对果糖磷酸激酶的变构调节作用（续）,抑制,激活,F-6-P和ATP对EMP的调节作用,F-6-P对磷酸化和去磷酸化的作用,葡萄糖异生跨越了酵解磷酸果糖激酶1催化的不可逆反应,果糖-1，6-二磷酸酯酶1,果糖磷酸激酶1,柠檬酸循环是燃料物质氧化分解的中心途径,丙酮酸脱氢酶复合物催化整个丙酮酸生成乙酰CoA的反应,Py dHE复合物的调节,PyCH3COScoA是一个重要的反应步骤，处于代谢的分支点，受到严密的调节作用：1）产物抑制 acetyl CoA和NADH都抑制Py dHE复合物，抑制作用为相应的反应物CoA及NAD+所逆转。2）核苷酸反馈调节(Nt feedback regulation)整个酶体系的活性由细胞的能荷水平所调控，体系受GTP(ATP)抑制，为AMP所活化。,Py dHE复合物的调节（续）,3）可逆磷酸化作用的共价调节（covalent regulation），ATP存在时，Py羧化酶分子上的Ser-OH被磷酸激酶催化磷酸化而没有活性，一旦磷酸基团被磷酸酯酶催化水解（去磷酸化）可恢复活性。细胞内ATP/ADP,acetylCoA/CoA,NADH/NAD+高时，磷酸化作用加强；Ca2+促进去磷酸化作用，insulin也可刺激去磷酸化作用。,柠檬酸合成酶(Citric acid synthetase),催化TCA的第一步反应，反应先生成柠檬酰CoA，再水解为柠檬酸，是放能反应，不可逆。是TCA的一个调节酶，活性受ATP、NADH、SuccinylCoA及长链脂酰CoA的抑制，对于TCA是一个rate-limitting step。氟乙酰CoA在酶的作用下与草酰乙酸生成氟柠檬酸，顺乌头酸酶只识别柠檬酸，对氟柠檬酸没有作用，致使TCA中断，这种合成为致死合成(lethal synthesis)。在代谢研究的应用上，这被广泛用于杀虫剂或灭鼠药的生产。,TCA循环过程,TCA简图,-酮戊二酸dHE,与Py dHE复合物的组成及作用非常相似，包括三个酶组分：1）-酮戊二酸 dHE(E1)2）琥珀酰转移酶(E2)3）二氢硫辛酸dHE(E3)还有六种辅助因子：TPP,CoA,FAD,NAD+,Lipoic acid(Lipoamide)及Mg2+。催化反应：-Ketoglutarate+CoA+NAD+succinyl CoA+CO2+NADH+H+酶也是调节酶，受产物NADH,succinyl CoA和Ca2+抑制；ATP、GTP对酶有反馈抑制；不受磷酸化的共价调节。,TCA是两用途径,回补反应,原核、真核,肝脏和肾脏,植物、细菌,心脏、骨骼肌,乙醛酸循环(Glyoxylate Cycle),微生物和植物可以在产乙酸或产生acetyl CoA的化合物中生长，因为它们存在两种酶：异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase）和苹果酸合成酶（malate synthetase），这样可使TCA循环中的异柠檬酸不经脱羧而被裂解酶裂解为琥珀酸和乙醛酸，乙醛酸与另一分子acetyl CoA在苹果酸合成酶作用下缩合形成苹果酸。意义：连接糖与脂的相互转变；协同TCA，造成C4的赢余,乙醛酸(Glyoxylate)循环,乙醛酸循环和TCA循环的关系,异柠檬酸脱氢酶活性的调节决定异柠檬酸向乙醛酸循环还是TCA循环,TCA的调节,1.底物的有效性2.产物的反馈抑制3.变