生物化学蛋白质课件.ppt
,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,第一章 蛋白质(Protein),第一节 概 述,一、蛋白质的定义 蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。二、蛋白质在生命中的重要性 早在1878年，恩格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”,具体生物学意义：,1.生物体的组成成分,2.酶,3.运输：,4.运动：,5.抗体,6.干扰素,7.遗传信息的控制,8.细胞膜的通透性,9.高等生物的记忆、识别机构,Na-K泵、,驱动蛋白介导的转运活动,离子转运,三、蛋白质的组成,1.元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳 50 氢 7 氧 23 氮 16%硫 03 其他 微 量,氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量,蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将非蛋白氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质；故：蛋白质含量=氮的量100/16或6.25,除了上法外，还有 紫外比色法 双缩脲法 Folin酚 考马斯亮兰G250比色法（条件：蛋白质必须是可溶的）,2.化学组成（两种类型）单纯蛋白质：水解（三种方法）为-氨基酸 缀合蛋白质=单纯蛋白质+辅基,第二节 氨基酸化学,一、氨基酸的结构与分类,1.氨基酸的结构氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从所有蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种（标准氨基酸，standard amino acids)，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1)与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸,COOHH2N CH-碳原子基团 R R基团,-氨基酸基本结构通式,(2)C如是不对称C（除Gly），则：具有两种立体异构体 D-型和L-型（蛋白质中的AA都是L型）.具有旋光性（手性）左旋（-）或右旋（+）,B,A.,2.构成蛋白质的20种氨基酸,3、常见蛋白质氨基酸的分类,1）按照R基的化学结构,（1）脂肪簇氨基酸,中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile含羟基或硫氨基酸：Ser、Thr、Cys、Met酸性氨基酸及其酰胺：Asp、Glu、Asn、Gln碱性氨基酸：Lys、Arg,（2）芳香簇氨基酸,Phe、Tyr、Trp,（3）杂环簇氨基酸,His、Pro,2）按R的极性性质,（1）非极性R基氨基酸,Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met,（2）不带电荷的极性R基氨基酸,Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln,（3）带正电荷的R基氨基酸,（4）带负电荷的R基氨基酸,Lys、Arg、His,Asp、Glu,注：二十种氨基酸的结构特点支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨 酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸亚氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：色氨酸含-氨基的氨基酸：赖氨酸,胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胍基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys,4.人体所需的八种必需氨基酸 缬氨酸(Val)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)苏氨酸(Thr)赖氨酸(Lys)蛋氨酸(Met)苯丙氨酸(Phe)色氨酸(Trp)婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)早产儿所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys),.几种重要的不常见pro氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸(存在于胶原pro)、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：,6、非蛋白质氨基酸,除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能。,（1）L-型氨基酸的衍生物：L-瓜氨酸和L-鸟氨酸（2）D-型氨基酸：D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）-、-、-氨基酸：-Ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）。,二.氨基酸的重要理化性质1.一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶，其形状因构型而异,溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能使水的介电常数增加，能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦(必需氨基酸都具有苦味，以苯丙氨酸和色氨酸的苦味最强)，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。Q：哪三个现象表明AA以两性离子存在？,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,2.氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液(近中性pH值)中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。Why?在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化,PH 1 7 10净电荷+1 0-1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,原因：-羧基pK1在2.0左右，当pH3.5，-羧基以-COO-形式存在。-氨基pK2在9.4左右，当pH8.0时，-氨基以-NH3+形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。,在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。起点：100%Gly+净电荷：+1第一拐点：50%Gly+，50%Gly 平均净电荷：+0.5 pH=pK+lgGly/Gly+=pK1=2.34第二拐点：100%Gly 净电荷：0 等电点pI第三拐点：50%Gly，50%Gly-平均净电荷：-0.5 pH=pK2+lgGly-/Gly=pK2=9.6终点：100%Gly-净电荷：-1,His咪唑基的pKa值为6.0，在pH7附近有明显的缓冲作用。在生理条件下，只有His有缓冲能力。血红蛋白中His含量高，在血液中具很强的缓冲能力。,甘氨酸滴定曲线,甘氨酸盐酸盐（A+）,等电点甘氨酸（A）,甘氨酸钠（A-）,3.氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2 结论：（1）当PHPI，AA带电性？在电场中的运动性？（2）当PHPI，AA带电性？在电场中的运动性？（3）PI与浓度的关系？,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,4.氨基酸的化学性质(1)与茚三酮的反应（颜色反应）,反应要点A.该反应由NH2与COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值D.测定范围：0.550g/ml E.脯氨酸（或羟脯氨酸）与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离，再测定CO2的量）B.氨基酸自动分析仪：用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,反应特点A.为-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）,(2)与甲醛反应,氨基酸的甲醛滴定,氨基酸两性离子的NH3+是弱酸，其pKa为9.7左右，完全解离时溶液的pH约为10，超出酸碱滴定指示剂的显色范围，不能用一般指示剂，例如酚酞，作酸碱滴定。但当氨基酸的氨基与中性甲醛结合成氨基酸二羟甲基衍生物后，其氨基的碱性即大大减少，反应向右进行，两性离子中NH3+基的离解度增加，释出H+质子，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶液的pH降至6.7左右，此时NH3+离解释出的H+即可以酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定。每释出的一个H+就相当于一个氨基酸。甲醛滴定可用来测定蛋白质的水解程度。当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域。这就是甲醛滴定法的基础。,小结：,A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,(3)与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,反应特点A.为-NH2的反应B.氨基酸-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与-DNP氨基酸区分和分离（-DNP氨基酸可溶于有机溶剂，而R基的DNP衍生物则不能，因此，可用有机溶剂抽提）,黄色,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.B.用酸水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.,肽分子与DNFB反应，得DNP-肽,层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,Sanger降解法的改进方法-DNS-Edman降解法用DNS(二甲基氨基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Sanger法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量,由Edman于1950年首先提出为-NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,苯氨基硫甲酰肽,噻唑啉酮苯胺,苯乙内酰硫脲AA,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨 基酸分离PTH-氨基酸层析法和HPLC等鉴定,用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链 灵敏度提高，能连续测定。多肽顺序自动分析仪 样品最低用量可在5pmol,（5）侧链R基参加的反应,氨基酸的侧链基团R有下列几种：,苯环(苯丙氨酸及酪氨酸)酚基(酪氨酸)-OH基(丝氨酸、苏氨酸)-SH基及SS键(半胱氨酸及胱氨酸)吲哚基(色氨酸)胍基(精氨酸)咪唑基(组氨酸),重要反应：,A.与酰化试剂反应：如丹磺酰氯；为-NH2的反应B.精氨酸的反应：胍基与1，2环已二酮；防止胰pro酶对Arg的 COOH所生成的肽键的水解C.Cys与乙撑亚胺的反应：SH的反应；为胰pro酶提供了新的水解位点D.胱氨酸的氧化与还原反应：二硫键的反应,E.其他反应成盐、成酯、成肽、脱羧反应,酪氨酸的酚基在3和5位上容易发生亲电取代反应，例如发生碘化或硝化，分别生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸：,与重氮盐结合生成桔黄色的化合物：,这就是Pauly反应，可用于检测酪氨酸。,组氨酸的侧链咪唑基与重氮苯磺酸也能形成相似的化合物，但颜色稍有差异，是棕红色。,精氨酸的侧链胍基在硼酸钠缓冲液(pH 89，2535）中，与1，2环己二酮反应，生成缩合物：,在胰蛋白酶水解肽段时，用于保护Arg的NH2，减少作用位点。,色氨酸的侧链吲哚基在温和条件下可被N溴代琥珀酰亚胺氧化。此反应可用于分光光度法测定蛋白质中色氨酸的含量，并能在色氨酸和酪氨酸残基处选择性化学断裂肽键。,蛋氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核基团，与烃化试剂如甲基碘容易形成锍盐。,生成的侧链带有正电荷(+NH3)，它为胰蛋白酶水解肽链提供了一个新位点，这对氨基酸顺序测定是很有用的。同时此反应也可用来保护肽链上的SH基、以防止被重新氧化为二硫键。,半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸(缩写为DTNB)或称Ellman氏试剂发生硫醇二硫化物交换反应：,反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的硫硝基苯甲酸的释放，它在pH 8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定一SH基。,硫基很容易受空气或其他氧化剂氧化。硫醇一般遇到的只有两种氧化衍生物：二硫化物和磺酸。,2R-SH 1/2O2 R-S-S-R+H2O2,半胱氨酸的SH基可与另一个SH基结合成二硫键(SS)。SH与SS成一氧化还原体系，在机体氧化还原作用中有一定作用。二硫键存在于多种肽和蛋白质分子中，胰岛素分子中有3个二硫键，核糖核酸酶分子中有4个二硫键。二硫键对蛋白质和多肽分子的立体结构有维系稳定的作用。二硫键可被还原剂破坏产生SH基。SH基可被氧化成磺酸基(HSO3基)。这两种反应在研究胰岛素和含二硫键肽的结构工作中都有用处。,丝氨酸、苏氨酸和羟脯氨酸的OH基能与酸结合成酯。在生物体蛋白质中，丝氨酸常与磷酸结合，酪蛋白中含有大量的丝氨酸磷酸酯。,
