《医学生物化学》PPT课件.ppt

h,1,第二章,蛋白质的结构与功能,Structure and Function of Protein,h,2,蛋白质的分子组成,1,蛋白质的分子结构,蛋白质结构与功能的关系,蛋白质的理化性质及其分离纯化,2,3,4,h,3,protein？,h,4,含量大,分布广,种类多,功能繁杂,蛋白质的重要性,1,2,3,4,h,5,蛋白质的生物活性,催化作用,调节作用,免疫作用,载体作用,凝血作用,收缩作用,缓冲作用,其它作用,h,6,第一节,蛋白质的分子组成,h,7,组成蛋白质的元素,C、H、O、N和S,主要,少量,磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘,h,8,蛋白质的含氮量平均为16,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,h,9,一 氨基酸（amino acid）,氨基酸是蛋白质的基本组成单位,自然界,300余种,人体,仅20种,除G外,均属L-AA,h,10,NH2,H,R,COOH,C,（一）氨基酸的一般结构,中心 碳原子,羧基,氨基,氢原子,侧链,h,11,L-AA,D-AA,蛋白质中为L-AA,h,12,h,13,（二）氨基酸的分类,非极性疏水性氨基酸,1,2,3,4,极性中性氨基酸,酸性氨基酸,碱性氨基酸,h,14,非极性疏水性氨基酸,h,15,极性中性氨基酸,h,16,碱性氨基酸,h,17,酸性氨基酸,h,18,胱氨酸,半胱氨酸,h,19,记忆口诀,甘、丙、缬、亮、异，三、四碳烃基,丙、丁羟丝、苏，（半）胱、蛋含有硫,酸有天冬、谷，碱有精、赖、组,苯、酪、色、脯环，中性天、谷胺,h,20,要点,编码AA 20种,除G外均为L-型,P为环状亚AA,含羟基AA：S、T、Y,含硫AA：C、M,芳香AA：F、Y、W,支链AA：V、L、I,酸性AA：D、E,碱性AA：R、K、H,h,21,（二）氨基酸的理化性质,1.两性解离及等电点,解离程度取决于所处溶液的酸碱度,氨基酸是两性电解质,h,22,等电点(isoelectric point,pI),在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,h,23,pH=pI,pHpI,pHpI,兼性离子,阳离子,阴离子,h,24,2.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸最大吸收峰 280 nm,h,25,3.茚三酮反应,在氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。,氨基酸定量分析方法,h,26,二 肽（peptide）,肽 氨基酸通过肽键缩合而成的化合物,肽键(peptide bond)一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,h,27,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,h,28,二肽 两分子氨基酸,三肽 三分子氨基酸,寡肽(oligopeptide)十个以内氨基酸,多肽(polypeptide)多个氨基酸,h,29,多肽链(polypeptide chain)许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构,氨基酸残基(residue)肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全,h,30,氨基末端（N末端）自由氨基的一端羧基末端（C末端）自由羧基的一端,多肽链有两端,h,31,丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸(ser-gly-tyr-ala-leu),h,32,肽单元（peptide unit）,肽键中4个原子C、O、N、H和与之相邻的 C1、C2位于同一平面,h,33,h,34,肽键(C-N)具有部分双键的性质,h,35,h,36,天然存在的活性肽,谷胱甘肽(glutathione,GSH),肽类激素及神经肽,抗生素肽,h,37,谷胱甘肽(glutathione,GSH),h,38,还原剂,清除H2O2,结合有害物质,GSH生物活性,h,39,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,h,40,肽类激素,促甲状腺素释放激素(TRH),h,41,第二节,蛋白质的分子结构,h,42,蛋白质的结构层次图,h,43,分子结构,一级结构（基本结构）,高级结构（空间结构）,三级结构,四级结构,-螺旋,-折叠,-转角,不规则卷曲,二级结构,h,44,蛋白质的一级结构(primary structure),肽链中氨基酸的数目及排列顺序包括二硫键的数目和位置,定义,主要化学键,肽键 有些蛋白质有二硫键,h,45,牛胰岛素的一级结构,h,46,蛋白质的二级结构(secondary structure),肽链主链骨架原子的相对空间位置不涉及氨基残基侧链的构象,定义,主要化学键,氢键,h,47,-折叠,-转角,无规卷曲,-螺旋,蛋白质二级结构的主要形式,h,48,-螺旋,h,49,h,50,要点,1,一圈3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm,2,螺旋稳定靠氢键，与螺旋长轴平行,呈右手螺旋,侧链影响螺旋的形成和稳定,3,4,h,51,-折叠(反平行),h,52,-折叠(平行),h,53,要点,1,顺向平行和反向平行两种构象,2,呈伸展、锯齿状结构,折叠的稳定靠氢键,3,4,侧链影响折叠的形成和稳定,h,54,-转角,h,55,超二级结构（模体motif）,多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体,h,56,钙结合蛋白,锌指结构,h,57,蛋白质的三级结构(tertiary structure),整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的整体排布,定义,主要化学键是次级键,疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力,h,58,h,59,肌红蛋白（Mb）的三级结构,血红素,铁原子,h,60,结构域(domain),结构域是是超二级结构基础上形成的一个或数个球状或纤维状的区域，能各行使其功能；是蛋白质三级结构的基本结构单位,h,61,细胞表面蛋白CD4分子4个相似结构域,h,62,蛋白质的四级结构(quaternary structure),两条或多条肽链蛋白质的每一条具有完整三级结构的多肽链称为亚基,亚基,化学键,主要 疏水作用次要 离子键、氢键,定义,亚基的空间排布,h,63,血红蛋白（Hb）的四级结构,链,链,血红素,h,64,蛋白质的分类,根据组成,结合蛋白质,单纯蛋白质,蛋白质部分,非蛋白质部分,h,65,根据形状,球状蛋白质,纤维状蛋白质,h,66,根据功能,调节蛋白,酶蛋白,运输蛋白,结构蛋白,h,67,根据分布,核蛋白质,膜蛋白质,h,68,第三节,蛋白质结构与功能的关系,h,69,蛋白质一级结构 与功能的关系,一级结构是空间构象的基础,一级结构是功能的基础,一级结构改变与分子病,h,70,一级结构是空间构象的基础,h,71,h,72,天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,变性RNaseA（无活性）,8M尿素,去掉尿素,h,73,分子伴侣(chaperon)是一类帮助新生多肽链正确折叠的蛋白质,h,74,防止肽段错误聚集,使错误聚集肽段正确折叠,保证二硫键的正确形成,分子伴侣功能,h,75,一级结构是功能的基础,结构相似，功能相似,胰岛素,细胞色素c,促肾上腺皮质激素和促黑激素,h,76,一级结构改变与分子病,分子病,由蛋白质分子发生变异所导致的疾病,案 例,镰刀状红细胞性贫血,h,77,h,78,h,79,（a）正常红细胞,（b）镰型红细胞,h,80,蛋白质空间结构 与功能的关系,空间结构是功能的基础,h,81,胰岛素原转变成胰岛素,蛋白质的功能依赖于特定的空间结构,胰岛素原（一条肽链）,胰岛素（两条肽链）,C肽,h,82,h,83,肌红蛋白,血红蛋白,血红蛋白的空间构象变化与结合,h,84,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,h,85,协同效应 一个亚基与其配体结合后，能影响其 中另一个亚基与配体结合能力的现象,协同效应(cooperativity),正协同效应(positive cooperativity)促进作用,负协同效应(negative cooperativity)抑制作用,h,86,h,87,配体与亚基结合后引起亚基构象变化的效应,变构效应(allosteric effect),h,88,蛋白质空间结构改变与疾病,蛋白质构象病（protein conformational diseases）,因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病,h,89,蛋白质空间结构改变与疾病,朊病毒蛋白(prion protein,PrP),h,90,第四节,蛋白质的理化性质及其分离纯化,h,91,蛋白质的理化性质,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为pI,（一）两性电离及等电点,h,92,pH=pI,pHpI,pHpI,兼性离子,阳离子,阴离子,P,NH3+,COOH,P,NH3+,COO-,P,NH2,COO-,h,93,（二）蛋白质的胶体性质,胶体稳定因素,颗粒表面电荷,水化膜,h,94,水化膜,h,95,（三）蛋白质的变性与沉淀,蛋白质的变性(denaturation)在某些理化因素的作用下，蛋白质中维系其空间结构的次级键（甚至二硫键）断裂，使其空间结构遭受破坏，造成其理化性质的改变和生物活性的丧失。,h,96,变性因素,变性本质,破坏非共价键和二硫键不改变蛋白质的一级结构,加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等,h,97,理化性质变化,黏度增大,溶解度降低,易被蛋白酶水解,h,98,应用,消毒,鸡蛋要煮熟吃,疫苗保存,h,99,蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能,蛋白质的复性(renaturation),h,100,天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,变性RNaseA（无活性）,8M尿素,去掉尿素,h,101,蛋白质从溶液中析出,蛋白质沉淀,沉淀本质,破坏水化膜,中和电荷,h,102,中性盐,沉淀方法,有机溶剂,生物碱试剂,重金属离子,h,103,应用,重金属中毒口服牛奶或生鸡蛋,h,104,变性与沉淀的关系,变性,沉淀,容易,不一定,h,105,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，不易再溶于强酸和强碱中,蛋白质的凝固作用(protein coagulation),h,106,（四）蛋白质的光谱吸收与呈色反应,280nm最大吸收峰OD280：Y、W,蛋白质的光谱吸收,h,107,双缩脲反应,蛋白质的呈色反应,酚试剂呈色反应,h,108,蛋白质的分离和纯化,方法 盐析 有机溶剂沉淀 调节pH 改变温度,（一）改变蛋白质的溶解度,h,109,将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀,盐析(salt precipitation),h,110,低温(04 0C)快速,有机溶剂沉淀,h,111,方法 离心 透析 超滤 凝胶过滤,（二）根据蛋白质分子大小不同分离,h,112,利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离,离心（centrifugation）,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,h,113,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法,透析(dialysis),纯化蛋白质浓缩蛋白质,作用,h,114,超滤,利用超滤膜在一定压力下使大分子蛋白质滞留，而小分子物质和溶剂滤过,h,115,凝胶过滤（gel-filtration chromatography）,按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析,h,116,h,117,方法 离子交换层析 电泳,（三）根据蛋白质电荷性质分离,h,118,离子交换层析（ion exchange chromatography）,利用蛋白质两性解离特性和等电点作为分离依据,h,119,h,120,电泳(elctrophoresis）,带点粒子在电场作用下向所带电荷相反电极移动的现象,支持物的不同分为薄膜电泳、凝胶电泳,h,121,SDS-PAGE,h,122,SDS-PAGE 可测定蛋白质分子量,h,123,蛋白质含量测定与纯度鉴定,凯氏定氮法,（一）蛋白质含量测定,紫外线吸收法,考马斯亮蓝染色法,Folin-酚试剂法,h,124,蛋白质纯度常用某一特定成分与总蛋白之比来表示，如每毫克蛋白质含多少活性单位,（二）蛋白质的纯度鉴定,h,125,多肽链中氨基酸序列分析,测定蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端,将肽链水解成片段，分别进行分析,Edman降解法测定各肽段的氨基酸排列顺序,比较多种水解法产生的肽链，通过组合排列对比，确定完整肽链中的氨基酸顺序,h,126,Edman降解法测定氨基酸序列,h,127,h,128,