【医学ppt课件】核酸的化学.ppt

【医学ppt课件】核酸的化学,本章主要内容核苷酸DNARNA核酸的性质,1868年 F.Miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为“核素”的核酸1944年 O.N.Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质1953年 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA 双螺旋结构模型 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则1970s 建立DNA重组技术1980s后 分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，提出并完成HGP,核酸化学的发展过程,上页 下页 章首,一、概述概念,核酸(nucleic acid)是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成。种类：DNA（脱氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）,“四核苷酸假说”：核酸由四种核苷酸组成的单体构成的，缺乏结构方面的多样性,不大可能有重要的生理功能。,1928年，英国 S型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑R型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙,著名的肺炎球菌实验,结果说明？,结果说明：加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌这种生物分子或遗传物质是什么呢？,著名的肺炎球菌实验,纽约洛克非勒研究所 Avery 从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到无害的R型肺炎球菌中，结果发现，惟独只有核酸可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌。1944年 结论：DNA是生命的遗传物质,分布：,DNA：主要在细胞核中，是染色体的主 要成分。此外在线粒体、叶绿体.RNA：主要在细胞质中，此外在线粒体、细胞核核仁；,二、核酸的组成成分,核酸是一种线形多聚核苷酸(polynucleotide),其基本结构单位是核苷酸(nucleotide)。,核苷酸的基本结构,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,(一)、核酸中的戊糖,从两类核酸的水解产物可看到它们组成的差别?,（二）碱基,核酸中的碱基分两类：1、嘧啶碱(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物。,嘧啶,1,2,3,4,5,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,2、嘌呤碱(purine)：由嘌呤衍生而来。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌呤 guanine,（G）,3、稀有碱基：,一些修饰碱基，因含量甚少而称之。大多为甲基化碱基，多在tRNA中。,（三）核苷：(nucleoside),核苷：戊糖与碱基缩合而成，并以糖苷键相连接。糖苷键：二者的连接是C-N键，称N-糖苷键。,腺 苷,尿苷,OH,假尿苷（）,核苷的表示：,核苷：A、G、C、U脱氧核苷：dA,dG,dC,dT修饰核苷：如5-甲基 胞嘧啶：m5dC。,（四）核苷酸(nucleotide，nt),1、种类：1）按酯化位点：可在核糖的2-,3-,5-；2）按核糖类型：核苷酸、脱氧核苷酸,核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化，即为核苷酸。,2、结构：,3、表示：,与一个磷酸结合MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMP与二个磷酸结合DP：如：ADP与三个磷酸结合TP：如：ATP,核苷酸,4、特殊核苷酸：,环核苷酸：核糖3-,5-成环。cAMP、cGMP 功能：第二信使 第二信使：通常把激素称为第一信使，激素与靶位受体结合后，生成某些物质，这些物质是联系激素引起生物学效应的重要物质，称为第二信使。例如：cAMP、cGMP等。,核苷酸,cAMP,cGMP,肌苷酸及鸟苷酸(强力味精),酶的辅助因子的结构成分 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,（五）核苷酸的连接方式,1、3-,5磷酸二酯键将核苷酸连接成核酸大分子。,一、核苷酸,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,2、核酸的一级结构：,多核苷酸链中各核苷酸残基的排列顺序称。,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,1）一级结构表示方法如上：,2）读向：,碱基序列从左到右表示5 3，由3-,5磷酸二酯键连接。若两链反向平行，则需注明每条链的走向。如：5A-T-G-C-C-T-G-A 3 3 T-A-C-G-G-A-C-T 5,核苷酸,三、DNA,（一）DNA 的一级结构：由数量庞大的4种脱氧核苷酸通过3-,5磷酸二酯键连接成的直线形或环形多聚体。,（二）DNA的双螺旋二级结构,1、双螺旋结构模型建立的依据：1）根据DNA碱基组成的定量分析提出chargaff碱基配对原则：A=T，G=C2）根据对DNA纤维和晶体的x-衍射分析。3）电位滴定证明。,DNA,双螺旋中的碱基对（base pair,bp),2,双螺旋结构的特点:(Watson-Crick模型）,1）形成：两条链反向平行；右手螺旋。,DNA,2）结构：,A、核糖-磷酸以3-,5磷酸二酯键连接成 骨架；碱基在内；B、大沟、小沟。,DNA,3）尺寸：,DNA,A、直径：2nm；B、碱基距离：0.34nm；C、一周10个核苷酸；D、螺距：3.4nm。,4）双螺旋的稳定性：,A、依靠碱基堆积力B、氢键C、离子键,3.DNA的二级结构类型,上页 下页 章首 节首,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（AT，GC）碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周为10碱基对（bp）A型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。Z型结构 左手螺旋，只有小沟,几种DNA螺旋主要构象参数,B-DNA与A-DNA,几种DNA钠盐的特点：,B-DNA：生理状态下多为此种；92%相对湿度A-DNA：右手螺旋；75%相对湿度；生理状态 下多见dsRNA、DNA-RNAZ-DNA：人工合成、左手螺旋；嘧啶、嘌呤交 替；有m5dC；与基因表达调控有关；此外，还发现有C、D、E等型。,DNA分子间三股螺旋结构模型,(三）DNA的三级结构,DNA双螺旋进一步扭曲即成三级结构。天然DNA有双链DNA（dsDNA），有的病毒为单链DNA（ssDNA）在dsDNA中：线形分子（大多数）环状分子（dcDNA）：质粒、线粒体、叶绿体、病毒、细菌,DNA,1、超螺旋结构,特点：可将长链压缩在一较小体内；密度大；凝胶电泳中移动速度快。,DNA,2、核小体中的 扭曲方式,在真核细胞染色质中，DNA双螺旋分子盘绕在组蛋白上形成核小体。许多核小体由DNA连成念珠状结构，再盘绕压缩成高层次的结构 染色体。,DNA,真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基本单位是核小体。,核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A，H2B，H3和H4。H2A，H2B，H3和H4各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。DNA双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。,（四）DNA的功能,1、DNA一级结构的特点 基因：是含特定遗传信息的核苷酸序列（DNA或RNA）是遗传物质的最小 功能单位。若干bp 多个基因 pr+DNA 染色体染色质是核中由DNA和蛋白质组成并可被苏木精等染料染色的物质，染色质DNA含有大量基因片段，是生命的遗传物质。,DNA,弄清几个概念 基因:基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。转录：DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中过程。翻译:把以mRNA为模板合成蛋白质的过程。结构基因:为RNA或蛋白质编码的基因.调节基因:只有调节作用,并不能转录生成RNA的片段.基因组:某生物体所含的全部基因称该生物体的。,1）原核生物基因组：,基因在同一染色体上。A、除调节序列和信号序列外，多为结构 基因；B、功能相关的基因常连在一起，并转录在 同一mRNA中；,DNA,C、基因有重叠；同一核苷酸顺序中包含多种生物信息。,2）真核生物基因组：,一般基因分布在若干染色体上。A、有重复序列；B、有断裂基因：即有内含子。内含子（intron)：DNA分子中不编码的序列。外显子(exons)：DNA分子中可表达的序列。,DNA,内含子与外显子,2、DNA是遗传信息的载体,半保留复制保证了亲代性状传到子代，保证了亲代与子代的相似性。,DNA,3、DNA是变异的物质基础,变异是生物进化的基础。变异的发生：1）DNA复制时出错；2）理化因素等引起碱基变化或缺失，使DNA碱基序列改变，从而发生性状变异。,DNA,四、RNA,（一）RNA的结构组成：4种核苷酸，有稀有碱基；连接：同DNA形成：一般以DNA为模板合成，有例外。结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。,（二）RNA的类型,三种：信使RNA（messenger RNA,mRNA)核糖体RNA(ribosomel RNA,rRNA)转运RNA(transfer RNA,tRNA),RNA,此外，在真核细胞中还有少量：,核内小RNA（snRNA）:参与核糖体的组成。不均一RNA（hnRNA）：mRNA的前体。反义RNA（asRNA）：可与mRNA部分或全部序列互补；抑 制DNA复制、转录；抑制mRNA翻译。,1、tRNA,约占全部RNA的15%；由70-90个核苷酸组成许多种类；沉降系数4S。,RNA,1）tRNA结构：,一级结构多已清楚，含较多稀有碱基；二级结构为三叶草 有：aa臂、二氢嘧啶环、反密码环、可变环、T 环P198,RNA,主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TC环含有T和；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,tRNA三级结构为倒L型,A、在pr合成中转运aa；B、在pr合成的起始、DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用。,2）tRNA功能：,2、mRNA和hnRNA,1）合成：以DNA为模板(核内)合成 hnRNA（含内含子和外显子）加工 成熟的mRNA 入细胞质 蛋白质合成,RNA,合成mRNA,切除内含子,2)mRNA结构特点：,3末端有polyA结构：与mRNA从核入质有关。5末端有帽子结构：G被甲基化，此可能与pro合成的起始有关。,3)功能：是蛋白质合成的模板,3、rRNA,1)占RNA总量的80%，是构成核糖体的骨架。2)核糖体功能：pr合成的部位.3）结构：分大、小亚基 一、二级结构多已确定，但功能不清。,RNA,原核细胞：70S核糖体；真核细胞：80S核糖体；,核糖体RNA自我剪切,1983年在四膜虫中发现RNA有催化功能,4、RNA的功能,1）在DNA复制、转录、翻译中起重要调控 作用；2）有催化作用；3）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。,RNA,五、核酸的性质,（一）一般理化性质1、两性电解质：2、溶解性：微溶于水，不溶于一般有机试剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶于水。0.14摩尔法:分离DNA蛋白和RNA蛋白的方法DNA蛋白:在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低.RNA蛋白:在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度较大.3、粘度高：一般DNA比RNA粘度高。4、水解性：可被酸、碱或酶水解，DNA比 RNA对稀碱稳定。,核酸的性质,5、颜色反应：,1）核糖与浓盐酸和苔黑酚(甲基间苯二酚)共热呈绿色，在 670nm处可测RNA；2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色，在595nm处可测DNA。二种反应可作定性试验，定量试验灵敏度低、准确性差，但快、简便。,核酸的性质,（二）紫外吸收性质,碱基具共轭双键强烈吸收260-290nm波段紫外光，最大吸收峰在260nm附近。应用：1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。1 OD相当于：50g/ml DNA 40g/ml RNA,核酸的性质,2、确定所提取的核酸是否纯品。1）DNA：OD260/OD280 1.8 纯品 2）RNA：OD260/OD280 2.0 纯品 在纯化DNA 时,通常用A260/A280=1.8-2.0 作为纯度标准,若大于此值,表示有RNA 污染;若小于此值,则有pro 或酚污染.,核酸的性质,（三）核酸结构的稳定性,1、碱基堆积力：双螺旋内部碱基形成的疏 水区；2、碱基间的氢键：3、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键,核酸的性质,（四）核酸的变性,1、变性的概念1）现象：双螺旋DNA和具双螺旋区的RNA氢键 断裂，空间结构被破坏，形成单链无规 则线团状的过程。,核酸的性质,2）结果：A、增色效应：260nm紫外吸收增加；B、粘度下降；C、生物学性能部分或全部丧失。3）引起变性的因素：温度、pH、尿素、甲醛等。,核酸的性质,2、热变性与Tm,Tm：在热变性中，紫外吸收增加的中点值所对应的温度，称该DNA的熔解温度（melting temperature,Tm);又称热解链温度。(G+C)%=(Tm-69.3)*2.44,核酸的性质,3、影响Tm的因素：,1）G-C含量：Tm与G-C含量成正比。2）介质中的离子强度：离子强度低，Tm低，在纯水中,DNA 在室温下即可变性。3）溶液的pH.4)变性剂,核酸的性质,（五）核酸的复性,概念：变性DNA在适当条件下（缓慢降温），可 使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结 构的过程。复性后，许多物化性质可得到恢复，生物学活性部分恢复。影响因素：温度、DNA片段大小、DNA浓 度、碱基重复序列多少、离子浓度。,核酸的性质,DNA变性与复性,六、分子生物学技术,（一）分子杂交与探针技术1、概念：1）分子杂交（hybrization):在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。DNA-DNA：DNA-RNA:,分子生物学技术,2)探针（probe),用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段.确诊病人细胞中提取的DNA；病毒DNA；肿瘤组织提取的DNA。,分子生物学技术,（二）限制性内切酶：,1、核酸的工具酶有：水解酶类；聚合酶类；连接酶；反转录酶等；,分子生物学技术,2、水解酶：水解磷酸二酯键,1）按专一性分：DNA水解酶、RNA水解酶2）按作用方式分：外切酶：从核酸链3或5一个个水解。内切酶：作用于核酸链内部。,分子生物学技术,3、限制性内切酶,在核苷酸链内特定序列切开DNA双链的酶。因切法不同，产生二种产物：交错切产生粘性末端：平切产生平头末端：,分子生物学技术,粘性末端,分子生物学技术,分子生物学技术,（三）Southern印迹法,分子生物学技术,用于检测DNA方法：如图,Northern 印迹法：用于检测RNA,（四）聚合酶链 式反应（polymeerase chain reaction,PCR),聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段,应用：,广泛用于克隆、测序、产生特异突变、医学诊断和法医.,原理：碱基配对；聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的 DNA新链；双脱氧核苷酸无3-OH，合成到此终止；可电泳分离随机得到的大小不等的片段。,（五）核酸序列测定,核酸序列测定,