发育生物学——发育生物学研究技术.ppt
发育生物学研究技术,常用发育生物学研究技术简介,显微镜技术(成像imaging);组织切片技术(经典解剖形态学morphology);生化分子生物学;原位杂交技术(in situ hybridization);显微注射;报告基因技术;细胞标记技术;,显微镜技术目的：观察胚胎个体分类：光学(optical)显微镜:体视显微镜:组织分离用 荧光显微镜：,显微镜技术激光共聚焦显微镜(laser confocal)：荧光标记，对胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性或定量研究；图像采集的效果很好；细胞或组织的三维重塑(reconstructing),组织切片技术目的：观察胚胎的内部组织学结构分类：石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片 冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样品中核酸的保存较好，但切片的质量差。,分子生物学技术目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育时期或特定组织中的表达分类：,Polymerase chain reaction(PCR):DNA amplification Real-time quantitative PCR:RNA 定量 RT-PCR/Northern blotting:mRNA expression Western blotting:protein expression 免疫共沉淀(Co-IP):protein-protein interaction,Northern Blotting Analysis,Southern Blotting Analysis,Real-time PCR 仪,原位杂交技术目的：检测某一特定基因mRNA在某胚胎和组织中的分布情况分类：,放射性标记探针：放射自显影 非放射性标记探针：地高辛(DIG)-免疫组化 荧光素-荧光免疫组化(FISH),原位探测基因表达,Gene expressing guiding development When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryosIn situ hybrid:probes-radioactive isotope,fluorescence tag or an enzymeDectection:autoradiography,fluorescence microscope,enzyme-substrate reaction,原位探测基因表达,原位探测基因表达,Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg.In situ hybridization with a radioactive probe.(yellow signals),原位探测基因表达,利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱,mRNA的检测,FISH 探测基因表达,报道基因(reporter gene)技术目的：用于启动子/增强子的分析研究。采用一些产物易于检测的基因(报道基因)与待研究的表达调控序列串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产物的表达来研究目的片断的转录调节活性。常用报道基因分类：,绿色荧光蛋白(GFP):分布用荧光显微镜观察 lacZ基因:编码-半乳糖苷酶,用特异底物显色研究其产物分布 荧光素酶(luciferase):常用体外基因表达活性分析，近年开始体内研究,启动子活性检测法,表达载体的构建：,利用大分子间的相互作用克隆新的基因,鉴定可与蛋白质结合的DNA序列分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay)克隆靶蛋白的表达基因。,利用DNA与蛋白质间的相互作用,分离时空特异性表达基因的方法,利用蛋白质之间的相互作用,酵母双杂交法,显微注射及细胞标记技术目的：将外源DNA、RNA或标记物等导入早期胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用于转基因分析。细胞标记物分类：,早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织 现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片 细胞内-荧光标记葡聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光显微镜或组织化学方法进行定位。示踪基因：GFP和LacZ基因,染料细胞标记,荧光细胞标记,细胞移植,DNA/蛋白芯片目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的基因或蛋白。,DNA chip Protein chip microRNA chip,分类：,应用DNA microarrays 研究基因表达,High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development,基因组时代：人类基因组计划,控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法,后基因组时代功能基因组时代,空间结构？,胞内分布及靶位？,影响器官？,基因类型？,底物？,影响途径？,发育遗传学技术,发育生物学基本任务之一：研究基因在胚胎发育中的作用正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。1.大规模诱变筛选;2.插入诱变筛选;3.突变基因的克隆;,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,自然群体中的突变体；化学诱变剂处理，如亚硝基乙脲乙亚硝基脲(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea,ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座子利用等；X射线或 r射线照射,获得突变体的方法,自发突变(spontaneous mutation),Recessive mutation(纯合体状态)/Dominant(杂合体状态)/semi-dominant,自发突变(spontaneouse mutation),semi-dominant mutation(半显性突变),斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996),从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,化学诱变法,大规模诱变筛选,通过射线或化学诱变剂处理父本个体，在其生殖系细胞中产生随机突变，然后与wild-type母本个体杂交，F1个体中可能携带有基因突变。F1与野生型，F2(50%杂合突变体)群体内杂交，F3(25%)可出现纯合突变个体，发育异常,DNA插入诱变法,反转录病毒插入引起的突变的鉴定,DNA插入诱变法,大规模诱变筛选,突变后的表型改变：致死性 功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效突变(null mutation)功能获得：如某些受体突变后活化,插入诱变筛选,利用转座子(transposon)或病毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因子，可以随即插入基因组中，并可以在基因组中移动，包括特殊序列和转座酶，后代生殖细胞中，转座酶就会诱导P-因子在基因中随即转座造成基因突变。,突变基因的克隆,突变体获得后，克隆引起该突变的基因 插入突变：利用P-因子序列作为探针，从突变体文库中筛选出含P-因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断的基因。化学诱变或射线突变：定位克隆(positional cloning)根据目的基因在染色体上的位置进行基因分离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核苷酸多态性(SNPs)。,Positional cloning:1)确定突变基因的染色体定位2)获取该片断的基因组序列：数据库3)生物信息学确定该片段可能含有的基因，结合其可能的功能和该突变体的表型，确定候选基因4)实验验证：功能异常，野生型rescue,RNAi,发育遗传学技术,反向遗传学技术：通过功能丧失(loss of function)或功能获得(gain of function)实验，研究胚胎个体所产生的表型而分析目的基因的功能。基因修饰 1.基因敲除;2.条件基因敲除;3.转基因;,Constructing knockout mice,获得携带有特定基因突变个体的技术，研究基因在发育中功能的重要方法。1)构建用于基因重组的突变基因结构2)重组基因导入胚胎干细胞(ES)3)注射ES入胚胎中以获得杂合性小鼠4)小鼠杂交获得纯合体小鼠并进行表型分析。,Conditional knockout,仅使靶基因在特定的组织或发育时期失活。Cre-lox 系统 1)Cre编码一种重组酶，可识别并结合位点并切除位于两个LoxP 位点之间的序列。2)两个品系：靶基因两侧都加入LoxP 位点;转入由组织特异性启动子控制的cre基因3)小鼠杂交，cre基因会在特异性组织中表达，切除靶基因，使之失活。,Transgenic technique,1)将外源基因注射到受精卵的细胞核中，缺点是无法控制外源基因的插入情况，只能通过后代检查DNA。2)将外源基因转化到ES中，同gene knockout3)小鼠杂交。,发育遗传学技术,反向遗传学技术：通过抑制性因子抑制目的基因的功能 1.RNA干扰;2.吗啉代寡聚核苷酸(MO):利用反义寡聚核苷酸抑制特定mRNA(5-UTR)的翻译而阻断目的基因功能的方法。主要应用在斑马鱼和爪蟾研究中，但现在也用于miRNA研究中。,RNAi 技术,1)双链RNA抑制含其同源序列基因的表达，抑制基因表达的新方法2)线虫中：直接导入dsRNA;脊椎动物中siRNA(21-23 nt),发育遗传学技术,反向遗传学技术：其它手段：1.显性抑制(dominant negative):通过过量表达显性抑制型蛋白(是通过某种修饰或加工，可以抑制野生型蛋白功能的缺陷型蛋白)以阻断内源蛋白的活性，研究其功能的方法。如将某些信号传导受体的膜内区域缺失等。2.基因捕获(gene trap)与增强子捕获(enhancer trap):是一种报道基因转基因技术，用于获得在某些组织中特异性表达的基因。如报道基因转入体内，如附近有内源性增强子，就可启动报道基因的启动子激活。,
