微生物传感器.ppt
微生物传感器,主要内容,1、前言2、微生物传感器的特点及其影响因素3、微生物传感器的原理4、微生物传感器的制备5、微生物传感器的测定系统6、微生物传感器的应用7、微生物传感器的应用实例8、微生物传感器的发展展望,1、前 言,生物传感器是一门集微电子学、材料科学、生物技术等学科为一体的高新技术。它由分子识别元件(感受器)和与之结合的信号转换器件(换能器)两部分组成的分析工具或系统。前者可以是生物体成分(酶、抗原、抗体、激素、DNA)或生物体本身(细胞、细胞器、组织),它们能特异地识别各种被测物质并与之反应;后者主要有电化学电极、离子敏场效应晶体管(ISFET)、热敏电阻器、光电管、光纤、压电晶体(PZ)等,其功能为将敏感元件感知的生物化学信号转变为可测量的电信号。,生物传感器,按所用分子识别元件的不同,按信号转换元件的不同,按对输出电信号的不同测量方式,酶传感器微生物传感器组织传感器细胞传感器免疫传感器,电化学生物传感器半导体生物传感器测热型生物传感器测光型生物传感器测声型生物传感器,电位型生物传感器电流型生物传感器伏安型生物传感器,微生物传感器是生物传感器的一个重要分支。1975 年Divies 制成了第一支微生物传感器,由此开辟了生物传感器发展的又一新领域。,在不损坏微生物机能情况下，可将微生物固定在载体上制作出微生物传感器。,构造微生物传感器必须注意：(1)以氧电极为基底的传感器的情况下，固定微生物的膜必须保持透气性；(2)传感器的敏感物质是基于活细胞，必须选择温和的固定化方法，使所固定的生物体不失活，保持生物识别元件的活性和稳定性是非常关键的步骤。,2、微生物传感器的特点及其影响因素,2.1 特点,同一般酶电极相比，微生物传感器具有以下优点：,1）稳定性好，使用寿命长2）微生物传感器响应迟钝时，可将其放在培养介质中浸泡使之恢复3）细菌细胞中一般含有多种酶，对于需要多种酶的反应，微生物传感器提供了方便4）有些酶至今尚无分离办法，可用含有该酶的细菌组成传感器5）微生物传感器可以克服酶价格昂贵、提取困难和不稳定的缺点,微生物传感器的不足之处：,1）由于细菌细胞内含有多种酶，使一些微生物传感器的选择性和灵敏度受到限制2）因底物需要通过细胞壁扩散，所以微生物传感器响应时间较长,2.2 影响传感器响应的因素,1）PH值：微生物传感器中细菌生长于转换器电极要求的PH值不一致时，需要找出一个折衷值2）缓冲溶液的种类和用量：Tris缓冲液可产生氨，而焦磷酸盐缓冲液对微生物有抑制作用，这两种缓冲液均不能用于用氨气敏电极作为转换器而组成的组氨酸微生物传感器。另外缓冲剂的缓冲容量不足时也会造成电极不符合能斯特响应。3）微生物的用量：增加细菌细胞的用量可使能斯特响应区增宽，但增加得太多又会导致响应减慢，而且传感器浸泡在缓冲液恢复到原来响应值的时间也相应增长。4）温度：微生物传感器虽也要求最适温度，但不像酶电极那样敏感。适当提高温度可使细菌细胞新城代谢以及底物的扩撒加快，从而使响应时间缩短。5）活化剂与稳定剂6）气体的影响,3、微生物传感器的原理,微生物传感器由固定化微生物、换能器和信号输出装置组成,利用固定化微生物代谢消耗溶液中的溶解氧或产生一些电活性物质并放出光或热的原理实现待测物质的定量测定,原理见下图：,微生物传感器原理示意图,固定化微生物是传感器的信息捕捉功能元件，是影响传感器性能的核心部件。它既要求将微生物限制在一定的空间,不流失，又要求保持微生物的固有活性和良好的机械性能。固定化技术决定传感器的稳定性、灵敏性和使用寿命等性能指标。,最早应用的换能器是电化学电极,主要有氧电极、二氧化碳电极等;随后出现了燃料电池、光敏二极管、场效应晶体管等其他类型的换能器。离子敏场效应管作为换能器被认为是发展新型微生物传感器的有效手段。,呼吸活性测定性微生物传感器,呼吸活性型微生物传感器由固定化需氧性细菌膜和氧电极组合而成。它是以细菌呼吸活性物质为基础测定被测物的。当将该传感器插入含有饱和溶解氧的试液中时，试液中的有机物受到细菌细胞的同化作用，细菌细胞呼吸加强，扩散到电极表面上氧的量减少，电流减小。当有机物由试液向细菌膜扩散速度达到恒定时，细菌的耗氧量也达到恒定，此时扩散到电极表面上的氧量也变为恒定，因此产生一个恒定电流。此电流与试液中的有机物浓度存在定量关系，据此可测定有关有机物。,代谢活性测定性微生物传感器,代谢活性型微生物传感器由固定化的厌氧菌膜和相应的电化学传感元件组合而成。它是以细菌代谢活性物质为基础测定被测物的。此类细菌摄取有机物产生各种代谢产物，若代谢产物是氢、甲酸或各种还原型辅酶等，则可用电流法测定；若代谢产物是二氧化碳、有机酸（氢离子）等，则可用电位法测定。根据测定的电流或电位便可得到有机物浓度的信息。,4、微生物传感器的制备,要得到一个好的微生物传感器需要从三方面考虑：一、要选择一种适合的微生物，它必须活性高，性能稳定且容易取得二、还需考虑与之配合的电化学装置要干扰少，灵敏度高三、就是将微生物固定化的问题。,4.1 微生物的固定化,常用的微生物固定化方法：吸附法、共价交联法、包埋法,（1）吸附法 吸附法是利用载体与微生物细胞间简单的物理吸附进行固定，即将菌悬液离心，过滤到醋酸纤维膜、滤纸或尼龙网膜上。也可借助于载体和细胞表面的静电作用，将细胞吸附在离子交换树脂膜上。此法最早被采用，其优点是对微生物无毒害，操作简便；其缺点是微生物易泄漏损失，造成传感器稳定性差。,（2）共价交联法 这种方法是通过交联剂把活细胞以共价键结合到载体上。交联剂有异氰酸盐、氨基硅烷、戊二醛及氰尿酰氯等。应用该法时由于共价键形成往往毒害了活细胞，故其应用受到一定限制。,（3）包埋法 包埋法是最常用的固定化微生物的方法。该法是将微生物活细胞包埋于适当的立体网状材料中，常用的包埋材料有聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜聚糖凝胶、海藻酸钙凝胶、琼脂、骨胶原等。聚丙烯酰胺凝胶是目前包埋细胞用途最广的一种。,该法的优点是对微生物细胞活性影响较小,微生物不易流失,膜的孔径和几何形状可以控制,膜稳定性高,可长时间储藏。缺点是分子过大的底物在凝胶网格内扩散较困难，因此不适合大分子底物的测定。,4.2 微生物传感器的电化学装置,氧电极是广泛应用于微生物传感器的换能器。在Clark型电极情况下，几何构型十分重要。特别是在阴极和膜之间的电解质层的厚度必须是紧密的，以保证良好的线性和低的背景电流。Clark电极分为极谱电极和电流电极两种。,极谱电极 由浸入同一饱和氯化钾溶液的铂阳极和银阴极构成。在阳极和阴极之间的极化电压，选择地降低阳极的氧。该反应产生电流，该电流与溶解氧浓度成比例。电流电极 有一个引导阳极和一个阴极产生电势差，因此，它是 一种自装置的电极，不需外供电压。这类电极简单且 经济，但缺点是响应时间慢，稳定性较差。,此外，微生物传感器中应用的换能器还有燃料电池型电极(氢气检测)、二氧化碳电极，氨电极、pH电极，其中除燃料电池型外，其余大部分是以电势为基础的，虽然测定范围比较广，但不足的是它们对其他污染物有响应且检测限度低。,许多物理装置也可用于微生物传感器换能器。主要有：热敏电阻：将固定化微生物膜与一热敏电阻紧连，测定放出的代谢热，即可制备微生物传感器。光探测器：将光合细菌与光探测器（例如光电倍增管或光电二极管）结合即可制备高敏性微生物传感器。,4.3 微生物传感器的组装,Clark氧电极由一个聚四氟乙烯膜，一个铂阴极，一个铝阳极和饱和氯酸钾电解质组成，将固定化微生物膜放置在聚四氟乙烯膜上，用O型圈固定透析膜使它紧紧地包住电极即组装成微生物传感器。,5、微生物传感器的测定系统,5.1 批式测定系统,传感器置于一恒温、循环水外套中，室内含有50毫升的0.05mol/L，pH7.0磷酸缓冲液、缓冲液用溶解氧饱和（通气速度200ml/min）并在测量期间电磁搅拌。用数字万用表和电子记录仪测量氧电极输出的电流。,当输出电流变得稳定时，将100l样品溶液注射入传感器室，下图给出了一个典型的电极响应曲线。,稳态表明细菌氧的消耗速率和氧的扩散速率从溶液到膜是相等的，稳态取决于葡萄糖浓度。当电极从试样液移出放入无葡萄糖的溶液时，微生物电极的电流逐渐增加并重新回到初水平。,在时间为0时的电流是在用溶解氧饱和的样液中的葡萄糖，于是由细菌消耗氧而引起溶解氧的减少，直至达到稳态。,5.2 流动测定系统,流室温度通过将温水流过夹套而维持30,用溶解氧饱和的0.01mol/min与250mol/min的流速与空气同时流入流室，当电极达到稳态时，样品以0.2mol/min的流速在20分钟内注射入流体室，注射间隙60分钟。,一般来说，微生物传感器具有较长的使用寿命，但其保养也是十分重要的。正常情况下，微生物传感器应贮存于无营养物、40的磷酸缓冲液中，以保持固定化微生物的活性无明显变化。如果活性降低，则必须将传感器浸入营养介质一定时间直至新细胞生长而活性重新恢复。此外，因不能试用抗菌试剂（例如叠氮化钠、抗菌素等），所以防止污染比酶生物传感器就显得更为重要。,6、微生物传感器的应用,1975 年Divies制成了第1支微生物传感器，到目前，微生物传感器可测定物质已达六七十种。微生物传感器不仅可以测定单一成分物质，如葡萄糖等各类碳水化合物、甲酸等各类有机酸、硝酸盐等各类含氮化合物和各类氨基酸等，还可以测定多种化合物的总量和集合效应。,在发酵工业领域，微生物传感器已应用于原材料、代谢产物的测定。应用微生物传感器可不受发酵过程中常存在的干扰物质的干扰，并且不受发酵液混浊程度的限制。,在生物工程领域，微生物传感器已用于酶活性的测定。微生物传感器还能用于测定微生物的呼吸活性，在微生物的简单鉴定、生物降解物的确定、微生物的保存方法的选择等方面也有应用。,在医学领域里，着眼于致癌物质对遗传因子的变异诱发性，人们利用微生物传感器对致癌物质进行一次性筛选。,环境监测领域是微生物传感器应用最广泛的领域，其典型代表是BOD 传感器。它可以测定水中可生物降解有机物的总量即生化需氧量。另外，微生物遇到有害离子CN-，Ag+，Cu2+等会产生中毒效应，可利用这一性质，实现对废水中有毒物质的评价。微生物传感器还可应用于测定多种污染物：NOx 气体传感器用于监测大气中氮氧化物的污染；硫化物微生物传感器用于测定煤气管道中含硫化合物；酚微生物传感器能够快速并准确地测定焦化、炼油、化工等企业废水中的酚。,7、微生物传感器的应用实例,Title:Microbial BOD sensor for monitoring treatment of wastewater from a rubber latex industry,Authors:Ampai Kumlanghan,Proespichaya Kanatharana,Punnee Asawatreratanakul,Bo Mattiasson,Panote Thavarungkul,To appear in:Enzyme and Microbial Technology 42(2008)483491,Schematic diagram of BOD monitoring system for anaerobic wastewater treatment process,BOD values from BOD5 standard method and biosensor.Biosensor results in(a)and(b)were analyzed off-line.,Percentages of BOD reduction are shown in(c)where the data were plotted at 5-day intervals.,8、微生物传感器的发展展望,微生物传感器最大的优点就是成本低、操作简便、设备简单，其在市场上的前景是十分巨大和诱人的。现已有报道加入专门抑制剂以解决微生物电极的选择性问题。另外，测定对象中的毒害因素如重金属和有毒有机物是影响微生物传感器稳定响应和寿命的关键因素，也是微生物传感器市场化的主要控制因素。因此，开发新的固定化技术，利用微生物育种、基因工程和细胞融合技术研制出新型、高效耐毒性的微生物传感器是该领域科研工作者面临的课题。相信微生物传感器作为一个具有发展潜力的研究方向，定会随着生物技术、材料科学、微电子技术等的发展取得更大的进步，并逐步趋向微型化、集成化、智能化。,
