微生物检测技术.ppt

微生物检测技术,1 微生物学检测方法,绝大多数企业和质检部门常用的微生物学检测方法有：标准平板计数法（SPC）和显微镜直接观察法（DMC）；改进方法：如皿膜系统、疏水网格滤膜法、螺旋板系统；此外，为了克服人工计数的缓慢与疲劳，许多学者发明了全自动菌落计数系统，如英国Bibby SC5菌落计数器，Spiral Biotech公司的CASBATM，Celsis公司的Scan500及Synopitics公司的全自动菌落计数器，均可快速、准确地计数。,2 生物学方法,PCR 技术基因探针技术基因芯片技术ATP生物荧光技术免疫学检测方法,2.1 PCR 技术,原理：聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。应用：不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。优点：PCR 技术具有灵敏度高、特异性强、抗污染能力强等；缺点：a容易受到乳品成分的干扰，从而使PCR 反应的顺利进行受到了抑制；b仅限于对那些核酸序列已知的微生物进行鉴定，不能区分活细胞和死细胞，同时其定量能力较差。,2.2 基因探针技术,核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。具备条件：应是单链应带有容易被检测的标记应用：目前利用较多的是抗生物素蛋白系统标记的非放射性核酸探针，该探针已在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒检测中得到了广泛应用；缺点：灵敏度不够高，一种探针只能检测一种菌，而且达到一定的检测量还要对样品进行一定时间的培养，使基因探针技术的应用受到一些限制。,3.3 基因芯片技术,cDNA分别标记Cy3和Cy5萤光信号）3.芯片制备（寡核苷酸探针或cDNA探针，包括PCR，纯化，点样等步骤）,基因芯片流程（三）,6.图像处理（采用专门软件，对图像进行分析，提取每个点上的数字信号，得到原始数据表）7.数据校正和筛选（对Cy5或Cy3信号进行校正，消除实验或扫描等环节因素对数据的影响，同时利用筛选规则对数据中的“坏点”，“小点”，“低信号点”，进行筛选，并作标记）8.目的基因或序列的确定（采用ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法如线性回归、主成分分析、调节P值算法等对差异基因进行统计推断）9.生物信息学分析（差异基因的同源性比对、相关文献检索）,优点：高通量检测、简便快速、敏感性高等方面,而且结果通过自动化分析,避免了由于操作人员之间差异导致错误结果,是食品安全方面的重大技术突破；缺点：基因芯片检测技术特异性有待提高，样品制备过程应进一步简化，而且仪器和耗材昂贵，且操作过程对工作人员要求较高。应用：利用毒力编码基因检测食品中的致病菌 利用16SrRNA基因等“看家基因”检测食品微生物种类和丰度,2.4 ATP生物荧光技术,原理：ATP分子能量通过荧光素酶复合物的作用转变为光，荧光强度与ATP浓度在一定范围内呈线性相关,而ATP在生物活细胞内的含量大致恒定，以此可推测被检样品中微生物数量。技术应用：标记细胞、病毒、细菌、基因表达和蛋白质的相互作用、转基因动物模型ATP生物荧光技术检测乳制品中的细菌总数及特异性病原菌具有简便、快速、灵敏等特点，在原料奶的验收、乳制品货架期预测及抗生素、细菌、噬菌体残留的检出等方面应用前景广阔。Samkutty等利用线性回归方程和ATP值预测了原料乳中的菌落总数。在卫生监测中，ATP生物荧光技术5 min即可检出结果，其数据与平板计数法的结果相关性大于80%。,（1）标记细胞,癌症与抗癌药物研究直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时的观测评估。免疫学与干细胞研究将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时观测活体动物体内干细胞造血过程的早期时间及动力学变化。细胞凋亡当荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无荧光素酶活性，细胞不能发光。,（2）标记病毒,病毒侵袭多种病毒，腺病毒，腺相关病毒，乙肝病毒等，以被荧光素酶标记，用于观察病毒对机体的侵染过程。,（3）标记细菌,细菌侵染研究可以用标记好的G+和G-细菌侵染活体动物，观察其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。抗生素药物研究利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，进行药物筛选和临床前动物实验。,