细胞生物学实验.ppt

细胞生物学实验,实验一 临时制片法 3 实验二 细胞膜的通透性观察 3 实验三 叶绿体的分离与观察 3 实验四 线粒体的超活染色与观察 3 实验五 植物组织培养技术 6 实验六 孚尔根染色 3 实验七 果蝇系列实验 3,实验一、细胞多样性观察-临时制片法,【目的要求】1、熟练掌握三种临时制片方法。2、掌握油镜的使用方法3、注意观察细胞核和细胞质及质膜、细胞壁 的形态(洋葱)。,【实验材料】,1、洋葱内皮细胞2、口腔上皮细胞3、人血细胞4、碘液：IKI5%乙醇配制而成。5、0.85%灭菌的生理盐水6、普通显微镜、擦镜纸、载玻片、盖玻片、压舌板(消毒)、滴管及滴帽、香柏油、二甲苯、消毒的注射针头、刀片、小镊子、棉花球。,A Typical Animal Cell,A Typical Plant Cell,普通光学显微镜,显微镜的分辨率与放大倍数,3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。D=0.61/NA=0.61/sin/2 其中为入射光线波长；NA为镜口率 sin/2，n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。思考：如何提高显微镜的分辨能力？,表一、几种介质的折射率,显微镜的几个光学特点,制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sin/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400700nm，分辨力数值不会小于0.2m，人眼的分辨力为0.2mm。,【操作方法】,1、取洋葱块茎，用刀片切下0.5 cm大小的小块时，小心用镊子夹住内皮，轻轻撕下，置于载玻片上，然后加2滴碘液，510min后，盖上盖玻片，同时用吸水纸拭去过多的碘液，随后置于显微镜下观察。2、滴2滴碘液于载玻片上，然后将压舌板于口腔两侧（任一）轻轻刮取口腔上皮细胞，于碘液上适当涂抺，最后盖上盖玻片。,人血细胞涂片,3、一般从人的耳垂或指尖取血。先将采血的耳垂或指尖用碘液和75%酒精消毒，用经过灭菌的刺血针扎破耳垂或指尖皮肤，让血液流出，除去第一滴后采样。在灭菌载玻片右面13处滴血一滴。取另一张载玻片做为推片，让推片的一端与血滴接触，并与血滴玻片成350400夹角。待血液沿着两块载玻片接触线向两边扩散后，将推片保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血玻片上形成一层血膜，即为血涂片。在血滴前推时，根据所滴血量多少，适时停推，盖上盖玻片。,4、显微镜观察方法,标本置于载物台上-先于低倍镜（10）观察-高倍镜（40）-上抬1cm-加香柏油到标本上-调节镜头（100），并使之埋入油中-适量调节粗、微调焦螺旋至看清材料-镜下观察，并绘图；实验结束，上升镜筒-滴加二甲苯-用擦镜纸擦拭镜头-将显微镜恢复原位，放入镜箱,注意事项与作业,【注意事项】1、做血涂片时，应该注意：推片的边缘要平滑。推血膜时，用力要均匀，保持角度，中途不能停止。若停止再推，血膜产生波纹，薄厚不均。推血膜时，如血滴大、角度大，速度慢，易出现较厚的血膜，对观察不利。2、做刮取口腔上皮细胞前，应超前漱口，以防残留的食物渣影响镜下观察。3、油镜使用完毕后，应及时用蘸有二甲苯的擦镜纸擦拭干净，以免油镜受到污染。【作业】1、绘图表示观察到的几种细胞形态（请标明放大倍数），并注明属何种制片法？,实验二、细胞膜的通透性观察,【目的要求】1、了解细胞膜对物质通透性的一般规律。2、了解溶血现象及其发生机制。,Typical plasma Membrane,Erythrocyte Membrane Skeleton,电镜下的红细胞,实验原理,细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。,扩散与渗透,水的渗透同样是从自由能高的地方向自由能低的地方移动，如果考虑到溶质的浓度，水是从溶质浓度低的地方向溶质浓度高的地方流动。,红细胞膨胀与收缩,将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。,限制因素,脂溶性 细胞质膜的通透性具有选择性。Size：质膜的通透性孔径不会大于0.5-1.0nm，能够扩散的最小分子是水分子。Polarity 极性物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性。脂溶性的、分子量小的、非极性物质易通过细胞膜,实验用品,1、材料：普通显微镜、普通离心机、扭力天平、10ml试管、10ml刻度离心管、试管架，2ml注射器（无需针头）或5ml移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔。2、试剂：0.128mol/L NaCl溶液、0.128mol/L NH4Cl溶液、0.128mol/L NH4AC溶液、0.128mol/L NaNO3溶液、0.09mol/L Na2SO4溶液、0.24mol/L葡萄糖、0.24mol/L甘油、0.24mol/L乙醇、0.24mol/L丙酮、0.128mol/L KNO3溶液、蒸馏水。3、材料：鸡血细胞。,操作方法,1、取鸡血lml，用O.128molL的NaCl溶液9ml洗涤3次(每次洗后需1000 rmin离心5min),最后配成30%的红细胞悬液。2、取11支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。,【观察结果】,1、试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（），镜检红细胞完好呈双凹盘状。2、如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（或），镜检有部分红细胞呈碎片。3、如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（），镜检发现细胞全部呈碎片。,【注意事项】1、鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。2、离心结束后，小心倾去上层血浆及中层血小板等成分，尽量控干。目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；3、试管中有红细胞和测试溶液时，不应摇晃，以免人为造成红细胞破裂。【作业】1、书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析(见表1)。,表1 各种溶液的溶血现象观察结果,目测法判断标准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：,各种溶液的溶血现象观察结果,实验三、叶绿体的分离与观察,【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。2、观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解,叶绿体,【实验原理】,将动植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状稠密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。,叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 rmin的条件下离心2 min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后，在3000 rmin的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0 5的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。,【实验材料】,1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机、扭力天平、光学显微镜。2、小型器材：500m1烧杯2个，250m1量筒1个，滴管10支，10m1刻度离心管20支，纱布若干，载玻片和盖片各4片。3、0.35mol/L NaCl溶液。4、新鲜菠菜。,【操作方法】,A、游离叶绿体的制备与观察1、选取新鲜的嫩菠菜叶洗净擦干后去除叶梗及组脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机低速(5000 rmin)匀浆35mm。3、将匀浆用200目尼龙网或6层纱布过滤，于500m1烧杯中。4、取滤液4m1在1000 rmin下离心2min。弃去沉淀。5、将上清液在3000 rmin下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。6、将沉淀用0.35molL NaC1溶液悬浮。7、取叶绿体悬液1滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。,B、组织中叶绿体的观察 取新鲜菠菜嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。,【观察结果】,1、在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜 下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2、表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈 无色。3、叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶 绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野下还可见 到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。4、叶脉导管呈螺纹状。5、保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。6、气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。,【作业】1、画出分离后的细胞组分（注明形态的放大 倍数）。2、分离细胞组分时，为什么要加0.35mol/L 氯化钠？,实验四、线粒体的超活染色与观察,【实验目的】1、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数 量与分布。2、学习一些细胞器的超活染色技术。,线粒体,【实验原理】,活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些持殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。,Janus green B,詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线校体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。,【实验材料】,1、器材：显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。2、Ringer溶液 氯化钠 0.85g 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml3、1%詹纳斯绿B溶液（原液）称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer，稍加微热(3040)，使之溶 解，用滤纸过滤后，即为1原液。4、詹纳斯绿B溶液（应用液）取1原液1ml加入49ml Ringer溶液,混匀即可。现用现配。5、肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞。,【操作方法】,（一）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1、取清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴2滴詹纳斯绿B应用染液。2、实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色1015min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。3、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染或蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。,（二）小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察,1、用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。2、在干净的凹面载玻片的凹穴中,滴加詹纳绿B应用液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体面系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(般需染2030min)。3、吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴子载玻片上，盖上盖玻片进行观察。在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。,(三)洋葱鳞茎表反细胞线粒仲的超活染色观察,1、用吸管吸取詹纳斯绿B应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱茎内表皮，置于染液中，染色1015min。2、用吸管吸去染液，加滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。3、在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核校挤至侧细胞壁处。细观察细胞质中线粒体的形态与分布。,【作业】1、绘制口腔上皮细胞中线粒体的形态与分布。,细胞的结构水平,陈勤 张蓓蕾,实验五 植物组织培养,一、植物组织培养概论,1、概念（广义）：在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，统称为植物组织培养。,2、概念（狭义）：利用植物外植体在固体培养基上培养，获得愈伤组织或完整植株，即为植物组织培养，也称离体培养或外植体培养。,一、植物组织培养概论,根据外植体来源和培养对象的不同，又分为：（1）外植体培养（2）悬浮细胞培养（3）原生质体培养（4）单倍体培养,3、植物组织培养的类型,使外植体（如叶片、茎段、根等）培养诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。主要用途研究植物生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；提取代谢产物。,（1）外植体培养,在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。,（2）悬浮细胞培养,利用外植体能培养出完整植株,从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。,完全在于高等植物细胞具有全能性,图121,一般用植物的体细胞（二倍体细胞），先经纤维素酶处理掉细胞壁，脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast）。特点：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株：,（3）原生质体培养,原生质体培养,通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。,（4）单倍体培养,植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也显示了广阔地应用前景。1、组织分化与形态结构；2、快速繁殖与去除病毒；3、花药培养与单倍体育种；4、幼胚培养与试管受精；5、抗体突变体的筛选；6、体细胞无性系变异；7、悬浮细胞培养与次生物质生产；8、超低温种质保存等；,4、植物组织培养的意义,5、植物组织培养的过程,本实验的主要内容,实验目的,实验用品,实验方法,培养基的配制一、培养基的制备二、培养基的分装三、培养基的灭菌,取材、消毒与接种一、取材与消毒二、接种三、培养与观察,作业,通过对培养基的配制、植物外植体的杀菌消毒、无菌接种、培养，熟练掌握植物组织培养的基本技术；通过对植物组织培养技术的理论学习与实验操作，全面认识借用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程即植物的全能性。通过在超净工作台上进行无菌操作训练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。,一、实验目的,二、实验用品,材料 事先一天浸泡的小麦新鲜的植物叶片仪器 高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱。用具 镊子、解剖刀、剪刀、接种针、铝饭盒、锡泊纸、记号笔 橡皮筋、酒精灯、火柴、酒精棉花球。,玻璃器皿 试剂瓶（50mL、100mL、1000mL）三角瓶（100mL）刻度吸管（0.5mL、1mL、5mL、10mL）培养皿（直径911cm）试剂与培养基 70%酒精95%酒精 0.1%升汞 无菌双蒸水 盛有培养基的培养瓶(已灭菌),一、MS培养基的配制、分装与灭菌1、大量元素 3、铁盐 2、微量元素4、有机物质 二、取材、消毒与接种三、培养与观察,三、实验方法,上周已完成,一、培养基的配制、消毒与分装,100倍微量元素母液(10ml),10倍大量元素母液(100ml),调节pH到5.8,100倍铁盐母液(10ml),培养基,100倍有机物质母液(10ml),定容到1000ml,生长素(500L)蔗糖(30g),加入琼脂条8g溶解,分装（每瓶40ml),高压灭菌,二、取材、消毒和接种,在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；正式接种前30min左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，2030min后接种；用自来水冲洗干净刚剪下的幼嫩的叶片，置于带塞磨口三角瓶中（在进入接种室室，应用70%酒精擦拭瓶外）。用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，戴好口罩，进入接种室；,（一）实验前的准备工作,二、取材、消毒和接种,用75的酒精擦拭工作台面和双手；用蘸有70酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台；把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上；,二、取材、消毒和接种,在超净工作台内，把植物叶片放进75酒精的培养皿中浸泡约30s，轻轻摇动15-30s，倒出酒精。加入0.1%升汞液，浸泡消毒510min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。倒出升汞液，用无菌水换35次，彻底清除残留叶面和瓶内的升汞液。用镊子把叶子夹入培养皿的吸水纸上，吸干水珠，把叶子切成35mm大的小片。,（二）接种全过程,取下接种器械，在火焰上灭菌。取已灭菌的培养基瓶，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开封口棉塞。把叶片迅速放入培养瓶，用接种针拨匀，塞上棉塞，扎上橡皮筋。用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号，标明接种日期、培养者姓名。,二、取材、消毒和接种,接种完毕后取出培养瓶，置26-28恒温培养室内，照光条件下培养，定期进行观察。,三、培养与观察,外植体消毒、培养室、超净台和操作者自身消毒是防止细菌污染的关键；放入培养瓶和接种用具（包括镊子、解剖刀、接种针须事前放入铝饭盒，经150160烘箱干热灭菌2-3小h）。在超净台中，预先置于95%酒精中。每一步操作如取接种工具、培养瓶等，均在点燃的酒精灯上进行消毒。在无菌操作过程中，切记把吸取溶液的枪头、枪和吸管直接放在超净台上，造成二次污染。在无菌操作过程中，不准打手机，也不准大声说话。接种结束后，清理和关闭超净工作台。,四、注意事项,1、根据枸杞叶片培养过程中所看到的结果，你认为2，4-D、6-BA和NAA对于形态发生过程各有何种影响？2、人工条件与植物离体器官、组织或细胞，经过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整植株的过程，能够说明什么问题？,五、作业,实验六 孚尔根（Feulgen）染色法,任课教师 查向东,一、实验目的,学习掌握Feulgen染色方法，鉴定蚕豆根尖细胞（或其它细胞）核内染色质或染色体上DNA的存在。,二、实验原理,细胞中的DNA受1N HCl，60水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。水解后，组织经水漂洗，再移至希夫(Schiff)试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。这个反应是Feulgen在1924年提出来的，细胞内只有DNA具有这种专一的反应，可对DNA进行定性鉴定。该染色法的特点是：染色特异性强，反差大，背景清晰。由于在一定范围内，染色程度与DNA的含量成正比，可以结合使用显微分光光度计等定量分析DNA。,希夫试剂是无色的碱性品红亚硫酸溶液。碱性品红（Fuchsin Basic，分子式NH2CH3C6H3C:C6H4(NH2)(Cl)C6H4-NH2，分子量C20H20ClN3=337.85）的基本成分是氯化三氨基三苯甲烷，为桃红色。碱性品红与亚硫酸作用时还原，从醌型变为苯型，生成N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，同时颜色由桃红色变为无色透明；当与醛作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈紫红色。,图1.碱性品红分子结构图,N-糖苷键在强酸溶液中不稳定。DNA中N-糖苷键比磷酸二酯键更不稳定，DNA中N-糖苷键比RNA的N-糖苷键也更不稳定。所以，适度的盐酸水解，可仅断裂DNA分子中的嘌呤碱基与脱氧核糖的糖苷键，使碱基脱落，DNA变为多聚脱氧核糖磷酸。脱氧核糖的C-1位置是暴露的自由醛基形式，与希夫试剂反应呈紫红色。水解时间和温度等条件的准确控制很重要。,图3.核酸连续水解的降解产物,图4.Feulgen hydrolysis curve.The ascending branch corresponds to DNA depurination while the downslope reveals the apurinic acid depolymerization.Maximal depurination corresponds to the curve plateau.,三、实验用品,(一)材料 蚕豆根尖细胞(二)器材 立式染色缸一套，镊子，载玻片，盖玻片，解剖刀片，小漏斗，铁架，吸水纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。(三)药品与试剂,药品：浓盐酸(36-38%)，碱性品红(碱 性 品 红；盐 基 品 红Fuchsin,basic；Basic magenta)，亚硫酸氢钠（NaHSO3）或偏重亚硫酸钠(Na2S205)，偏重亚硫酸钾(K2S205)，1N HCl，70%及50%的乙醇，加拿大中性树胶，乙醇，二甲苯。Schiff试剂的配制:称取0.1克碱性品红，加到已经煮沸的100毫升蒸馏水中，继续煮沸34分钟，待溶液冷却到50时过滤。等溶液冷到25以下时，加入10毫升1N HCl和0.5克亚硫酸氢钠。此时若发现试剂中有不溶的固体颗粒，可用新华滤纸滤去。最后装在棕色瓶中，塞紧瓶塞，于4、暗处放置。,漂染液的配制：首先配制10%亚硫酸氢钠溶液；然后取该溶液10毫升，加200毫升蒸馏水，再加10毫升1N HCl，即成漂染液。使用前配制。,四、实验步骤,1.固定：蚕豆根尖材料用卡诺固定液处理4-8小时，贮存在70%乙醇中备用。2.准备：取出根尖，先后用50%乙醇和蒸馏水漂洗2次。用吸水纸吸干上面的水分。3.水解：将根尖在冷（室温，下同）的1N HCl 中浸1-2min 后，转移到60（0.5）的1N HCl，温育10-15min,随后用冷的1N HCl略洗，蒸馏水漂洗,倒去蒸馏水。4.染色：取出片子，放入含有Schiff试剂的染色缸中，用黑纸包好，染色3小时以上。,5.漂洗：倒去希夫试剂，用漂洗液洗3次，每次3-5分钟。流水冲洗10-15分钟，然 后用蒸馏水洗1次。6压片：置根尖于载玻片上，加一滴45%乙酸。加盖玻片，压片。7.镜检：在显微镜下观察，可见到间期核中的染色质和分裂其中的染色体被染成紫红色，而细胞质和核仁未被着色。8制作永久片：选择较好的压片，制成永久片。,五、实验说明,1.配制希夫试剂时，注意氧化剂与还原剂的当量，必须使试剂呈现无色，才可以用于染色反应；2.材料用卡诺固定液固定的时间过长会水解 DNA，影响后来的颜色反应；3.要控制好水解反应的条件。温度不能过高，高了醛基受到破坏，低了水解不充分，醛基不能释放出来。根据材料等的不同，水解的时间长短要根据预试验结果，取一个适当的时间。,附：染色效果与有丝分裂示例图,蚕豆根尖细胞有丝分裂,蚕豆根尖细胞，示染色效果,蚕豆根尖细胞，示染色效果,洋葱根尖细胞的有丝分裂,六、实验报告作业,1绘制你所看到的图像，若有有丝分裂，说明是有丝分裂的哪一期。2说明为什么Feulgen染色法不对RNA染色。3.总结实验成败原因。,参考文献1.Maria Luiza S.Mello.Cytochemistry of DNA,RNA and nuclear proteins Brazilian Journal of Genetics,20,2,257-264(1997)2.查向东，余凤安.对孚尔根染色法的改进及讨论.生物学杂志,1997，3：37-38.3.染色体遗传导论 李栒编著。湖南科学技术出版社1991,9:462-464.,实验七 果蝇系列实验,指导教师：尹若春 张萍萍 王丽丽 王剑锋,果蝇遗传学研究的好材料,高等生物，二倍体体型小，生活史短容易饲养生活力强，子代多突变类型多有着复杂的行为研究结果可以直接推广到其他动物和人类广泛应用于遗传学和发育生物学研究,总体实验设想,以同学为主体同学们自己培养果蝇，经常观察为果蝇唾腺染色体实验和杂交实验提供材料开放实验室只要在工作时间，同学们都可以到实验室进行操作（没有课的时候）,主要实验内容,实验一、果蝇观察与培养实验二、果蝇唾腺染色体制片与观察实验三、果蝇杂交伴性遗传实验四、果蝇同工酶的遗传分析,系列一、果蝇观察与培养,实验目的：了解果蝇的生活史及各阶段形态特征，了解几种常见的果蝇突变型掌握鉴别果蝇雌雄的方法学会果蝇的饲养管理和基本实验操作技术实验原理：果蝇的生物学知识,果蝇的生物学,实验材料为黑腹果蝇，属昆虫纲，双翅目，果蝇属的一个种。成虫体小，长仅4-5毫米。属完全变态发育。染色体数目少，2n=8，XY/XX,果蝇的生物学,果蝇的雌雄,果蝇的生物学,生活史：从果蝇卵到成虫期约需1015天。成蝇存活约15天。羽化后的果蝇一般在12小时后开始交配，两天后产卵。卵长约0.5毫米，呈白色，椭圆形，其前端有触丝。12天后，从卵孵出幼虫。经过两次蜕皮，3龄幼虫长约4.5毫米，肉眼可见一端稍尖为头部，有一黑点为口器，稍后有一对半透明的唾腺。约58天后，变成蛹，呈梭形。再经46天左右，从蛹羽化出成蝇。,果蝇的生物学,约有400多种形态突变型,野生型-灰身、红眼,突变型-黄身,突变型-白眼,野生型-灰身、红眼,突变型-朱红眼,突变型-黑眼,突变型-棒眼,突变型-短翅,突变型-卷翅,突变型-残翅,野生型横隔脉 突变型缺横隔脉,野生型-刚毛,突变型-分叉刚毛,突变型-短刚毛,果蝇基本操作技术麻醉,为便于观察，需将果蝇预先麻醉。将成蝇放入麻醉瓶，立即盖好瓶盖，瓶盖附有棉花团，预先滴上少量乙醚。大约半分钟后，成蝇会被麻醉昏迷。将其倾倒在白纸上进行观察。注意果蝇麻醉过度会死亡，死亡果蝇翅外展，与身体呈45角。被麻醉的果蝇不直接放回培养基上，以免粘住。最好将果蝇先放在消毒滤纸做成的小圆锥体中，一同放入瓶内；或暂时先将培养瓶侧卧。,果蝇培养基制备,A:sucrose 6.2g;agar 0.62g;water 38ml 加热溶化B:maize powder 8.25g;water 38ml 加热混匀后，再加入0.7g酵母粉A和B混合成糊状，加入0.5ml丙酸，混匀后分装到试管中115度灭菌20分钟,其他操作技术,棉塞制作试管捆扎灭菌锅使用,今天的主要工作,配制培养基并灭菌,1、称量时去准备室2、每2组合作配制培养基，分别准备A和B3、分装时要迅速，趁热分装4、每组试管捆扎，写上组别或姓名5、安排2-4名同学灭菌,几个注意点,不明白不清楚的地方要及时问，避免失误造成实验失败或事故注意实验室要求，规范操作安静有序,实验报告,简述果蝇的生活史。本实验中关键的操作有哪些？你所观察到的雌雄果蝇的差异。,系列二、果蝇唾腺染色体观察,实验目的,观察果蝇唾腺染色体的形态特征练习剖取果蝇三龄幼虫唾腺的方法掌握果蝇唾腺染色体的制片技术,实验原理,幼虫的培养：为了制备好的唾腺染色体玻片标本，首先需要有合适的培养条件以得到肥大的幼虫。（1）制片前710天，将果蝇接种在培养基上，为避免个体多，接种适当少些，一培养瓶中以10对左右为宜。最好每两天将亲本移换一次，以免产过多的卵。（2）将培养瓶移至阴凉处，大约为1618。（3）用营养丰富的合适培养基，可以补加些酵母粉，适当增高水的比例和降低琼脂比例。在幼虫出现后，还可往培养基中补加 210的酵母液数滴。,唾腺的剥取：选肥大的即将化蛹的三龄幼虫，放于载片上，加1滴生理盐水。于解剖镜下，用解剖针按住幼虫后部1/3处，另一手持针压住头部向前拉，将头部从身体拉开，唾腺即随之而出。这是一对半透明的长形小囊，其前端呈三叉形。尽可能把附在腺体旁边的脂肪剔除。除去幼虫残体。,双翅类昆虫（摇蚊、果蝇等）幼虫期的唾腺细胞很大，其中的染色体称这种染色体比普通染色体大的多，宽约5m，长约400m，相当于普通染色体的100-150倍，因而又称巨大染色体。唾腺染色体经过多次复制而并不分开，大约有1000-1400根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体。多线染色体经染色后，出现深浅不同、密疏各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的，代表着果蝇等昆虫的种的特征。如染色体有缺失、重复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体上识别出来。,压片：先将唾腺加一滴1N盐酸，处理23分钟，用滤纸吸干盐酸，再用蒸馏水洗23遍，再吸去多余水分。滴加醋酸洋红染液（或改良品红，龙胆紫等）。染色数分钟至20分钟，待唾腺着色后，盖上盖片于显微镜下观察，可看到细胞核呈红色，说明其中的染色体已着色，此时进行压片。在玻片上下加滤纸适当加压，可用铅笔滚压，或用镊子、拇指、橡皮头敲压，将核压破，使染色体伸展开。显微镜下可观察染色体的形态和染色体横纹。,