遗传毒理学研究生.ppt

遗传毒理学,遗传毒理学(genetic toxicology),研究环境因素对机体遗传物质和遗传过程的作用,阐明遗传毒性对机体健康的后果及其作用机制,为防止环境因素对遗传物质的损伤、增加生物的遗传负荷，保护生态平衡和人体的健康提供科学依据的一门毒理学分支学科。,突变研究简史,突变(mutation)突变是一种遗传状态，是可以通过复制而遗传的DNA结构的永久性改变。,按突变发生方式 自发突变(spontaneoue mutation)诱发突变(induced mutation)按致突变物作用方式 直接致突变物(direct-acting mutagen)间接致突变物(indirect-acting mutagen)或前诱变物(promutagen),突变分类,遗传毒物(genotoxic agent or genotoxicant)致突变物对生物体的起始作用点是遗传物质,故也称为遗传毒物遗传毒性(genetic toxicity or genotoxicity)遗传毒物引起生物细胞基因组分子结构特异改变的有害效应称为遗传毒性也称为基因毒性,非程序DNA合成 姐妹染色单体交换 DNA链断裂 非整倍性和多倍性,下列改变属遗传毒性而非致突变性,遗传毒性与致突变性的区别,第一节 遗传毒性的类型,从遗传学角度或突变角度可分为 基因突变 染色体结构改变 染色体数目改变从遗传毒性角度 除以上三种外，还包括DNA损伤,从机理角度 以DNA为靶的损伤(包括基因突变和染 色体结构畸变）不以DNA为靶的损伤(主要指染色体数 目畸变，包括整倍体和非整倍体改变）Thilly(1986)主张分为 基因突变作用 断裂作用 非整倍体作用,基因突变:是指基因在结构上发生了碱基对组 成和排列序列的改变。突变体:是指有机体的表型特征中有一种(或 多种)与野生型个体的该特征有所不同，具有这样遗传状态的有机体就叫做突变体,一、基因突变的类型,突变基因：突变位点可能存在于基因内，该基因称为突变基因.野生型基因：没有发生突变的基因称为 野生型基因。野生型：是指有机体的正性状.,碱基对替换(base-pair substitution)移码突变或移码框突变(frameshift mutation)三核苷酸重复(triplet repeats)大段损伤(large fragment damge),(一)根据基因结构的改变,ABCDEFGHIJ,ABCDEKLMFGHIJ,ABCD GHIJ,ABCKLMGHIJ,ABCDEFDEFGHIJ,ABCDEFGHIJABCDEFGHIJ,ABCDEFGHIJABCDEFGHIJABCDEFGHIJ,ABCDEFGHIJ,ABCGFEDHIJ,正常插入缺失取代重复内重复放大到位,大段损伤包括：,(二)根据对遗传信息的改变,同义突变:是指没有改变基因产物氨基酸序列的改 变，显然这与密码子的兼并性相关.错义突变:是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸 序列的改变的,致死突变:发生在必需基因上，严重影 响蛋白质的功能错义突变 渗漏突变:突变的产物仍有部分活性，表 现型介于突变型与野生型之间中性突变:突变不影响或基本不影响蛋白 质的功能，性状改变不明显.,链终止突变 是指无义突变使肽链过早终止延长突变 是指如果终止密码子因突变而为 氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象,无义突变:是指某个碱基的改变使代表某个 氨基酸的密码子变为蛋白质合成 的终止密码子导致多肽链在成熟 之前须终止合成,(三)根据突变效应方向分类,正向突变:是指改变了野生型性状的突变回复突变:是指突变体所失去的野生型性 状可以通过第二次突变恢复,突变型,野生型,回复突变,正向突变,二、染 色 体 畸 变,染色体畸变:由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失，或引起各种重排，从而出现染色体结构异常的称为染色体畸变或染色体结构畸变断裂剂:凡能引起染色体断裂的物质断裂作用:染色体断裂作用的发生或过程即为断裂作用。,染色体型畸变染色单体型畸变,染色体畸变的分类,可能发生整个染色体的断裂或染色单体的某一条断裂,稳定性染色体畸变 非稳定性染色体畸变,臂间倒位,人类无着丝粒和双着丝粒染色体,无着丝粒环,断裂剂的分类拟紫外线断裂 只能诱发DNA单链断裂 拟紫外线断裂剂的作用结果必须经过S期之后 才显现出来，所以又称为S期依赖断裂剂 在S期或S期之前很短的时间 内发生染色单体断裂,拟放射断裂剂可诱发DNA双链断裂剂,能在细胞周期任一 时期发生作用不需经过S期的复制即可在中期相观察到 染色体结构改变，故又称S期不依赖断裂剂,染色体数目异常：又称染色体数目畸变，也称 基因组突变(genomic mutation)，主要指染色体的 数目发生了改变标准:以动物正常染色体数目2n为基准,整倍体,单倍体三倍体四倍体,非整倍体,近二倍体(2n-)亚二倍体超二倍体(2n+),三、染色体数目异常,染色体数目异常的基本类型,注：A.B.C.D.代表非同源染色体,第二节 遗传毒性的形成机制,致突变机制模式DNA损伤修复突变DNA损伤(DNA damage)是指在遗传毒物作用下，DNA结构和功能发生改变，阻碍了DNA的复制与转录或复制与转录产物发生改变,碱基类似物的取代链间嵌入DNA链断裂DNA碱基修饰碱基烷化和共价结合DNADNA交联DNA蛋白质交联等,DNA损伤的类型,一、DNA损伤(一)DNA加合物和交联分子的形成 大加合物代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B和芳香胺类后 果：DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位 DNA的半保留复制和转录。小加合物代表物：烷化剂、亚硝基化合物后 果：对DNA的构象影响较小，易导致碱基错误配对。DNA-DNA交联 DNA分子上一条链的碱基与互补链 上的相应碱基形成共价连接，称为DNA-DNA交联.如 亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气各种铂的衍生物,(二)碱基类似物在DNA复制时的掺入 BU A:T G:C or G:C A:T,A.T,A.BU,掺入,复制,A.T,G.BU,复制,A.T,G.C,A.T,A.BU,+,A.T,G.C,G.BU,G.C,A.BU,+,G.C,G.C,A.BU,掺入,复制,复制,+,+,AP A:T G:C,A.T,掺入,AP.T,复制,AP.T,A.T,+,AP.T,A.T,A.T,G.C,+,+,复制,复制,(三)DNA分子上碱基的化学修饰 亚硝基引起的氧化脱氨反应 NH2OH的致突变作用 烷化剂的致突变作用,(四)嵌合剂的致突变作用嵌合剂,原黄素,丫啶橙,染料分子,插入一个碱基,代表物：丫啶橙、原黄素等丫啶类染料分子方 式：以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之 间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间后 果：移码突变,(五)转座成分的致突变作用 生物体内含有许多转座成分，通过一种复杂的方式复制，一个复制拷贝保留在原来的插入部位，将另一个复制拷贝插入到基因组的另外一个位点。复制插入到第二个部位的过程称为转座(transposition)。如：哺乳类动物的DNA病毒和反转录病毒等后果：移码突变，基因的中断、失活、结构的改变等，甚至还会带入某些有害基因，增加基因突变的频率。,(六)增变基因 生物体内有些基因与整个基因组的突变率直接相关,当这些基因突变时，整个基因组的突变率明显上升，因此把这些基因称为增变基因(mutator genes)。(七)DNA的构象改变,(八)突变热点：基因中极易受攻击的位置，其突变频率大大高于平均数，这些位点就称为突变热点(hot spots of mutation)。突变热点并非完全随机分布诱发突变和自发突变中均有突变热点。形成原因：5甲基胞嘧啶(5mC)存在，5mC经脱氨形成胸腺嘧啶。在短的连续重复序列处容易发生插入或缺失突变，突变热点还与突变剂有关,二、DNA修复,DNA损伤修复按其机制可分为损伤修复机制（repair mechanisms）损伤耐受机制（tolerance mechanisms）,(一)损伤的逆转O6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶(O6-alkylguanine-DNA alkyl transferase,AGT)或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)修复系统,(二)碱基切除修复(base excision repair,BER)由DNA N-糖基化酶启动,(三)核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair,NER),全基因组核苷酸切除修复 转录偶联性核苷酸切除修复 DNA修复合成,（四）链断裂的修复,单链断裂的修复 双链断裂的修复 单链退火(single-strand annealing,SSA)DNA非同源性末端连接(NHEJ)重组修复(recombinational repair,RR),（五）跨损伤的DNA合成（六）错配修复(mismatch repair,MMR),原核细胞的错配修复大肠杆菌中DNA腺嘌呤甲基化(DAM)指导的修复途径。真核细胞的错配修复酿酒酵母已鉴定了6个MutS同源物和4个MutL同源物、PMS1PMS为post-meiotic segregation(减数分裂后分离)的缩写,三、整倍体和非整倍体的形成,(一)对DNA合成和修复有关的酶系统的作用(二)对纺锤体的毒作用 与微管蛋白二聚体结合 与微管上的巯基结合 破坏已组装的微管 妨碍中心粒移动 其它作用,四、诱重组效应(recombinagenic effects),很多致突变物和致畸物可增加生物体（真菌、植物、昆虫和哺乳动物）中有丝分裂重组频率(Hoffmann,1994)，这类物质称为重组剂(recombinagens)，有丝分裂重组令人感兴趣还因为它与某些肿瘤的病因有关,DNA损伤修复的效率,体细胞突变,生殖细胞突变,良性肿瘤,恶性转化,细胞衰老,分化的胚胎细胞受损,未分化的胚胎细胞,显性致死,隐性致死,存活突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷(流产/死胎)癌变,出生缺陷(功能或结构畸形),流产死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,一、遗传毒性的后果,第三节 遗传毒性的后果及其形成机制,二、遗传毒物对细胞周期的影响,细胞周期监控机制的破坏 细胞周期驱动机制的破坏,三、遗传毒物对细胞凋亡的影响,四、遗传毒物对细胞信号转导的影响,正常DNA,DNA损伤,DNA修复过程,未修复的DNA,损伤表达,断裂的DNA分子,染色体结构异常,基因突变,细胞死亡,非整倍体多倍体,重组事件 SCE 有丝分裂性交换,染色体分离异常,细胞屏障,遗传毒物,无误修复,易错修复,细胞分裂,突变发生中的事件及遗传学终点的关系,第四节 遗传毒性的检测方法,致突变性评价方法,通常可采用直接测试某种遗传学终点(基因 突变、染色体畸变、非整倍体)，以确定受 试物是否有致突变性 通过测定在遗传学终点前的通道上发生的 某一事件(如DNA损伤、DNA修复、姐妹染色 单体交换等)来预测化学物是否具有损伤 DNA的潜力 通过损伤引起的后果(如某种酶的丢失、某种功能的改变)等间接揭示发生的突变,分三大类检测基因突变检测染色体畸变测定DNA损伤的标志,损伤修复的激发加合物的形成姐妹染色单体交换体细胞重组链断裂,一、基因突变检测方法,(一)微生物分析 沙门氏菌/组氨酸回复突变分析 大肠杆菌Trp回复突变分析 酵母菌正向/回复突变分析,(二)哺乳动物细胞突变分析近年来由于人工培养细胞技术的发展，已获得了具有稳定突变表型(营养缺陷、药物抗性等）的哺乳动物细胞珠系。主要涉及三种酶的基因。,研究基因突变常用的体外哺乳动物细胞株,TK：胸苷激酶，HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶OR：毒毛旋花苷抗性,HGPRT缺陷型细胞株：是最常用的基因座，有关结构基因或调节基因发生碱基置换、移码甚至X染色体重排，均可引起嘌呤类似物的抗性。,NMP HGPRT,次黄嘌呤或鸟嘌呤类似物,细胞死亡,新合成途径,NMP HGPRT突变,8-AG,次黄嘌呤或鸟嘌呤类似物,8-AG,HGPRT缺陷型细胞株表现8-AG抗性,Brdu抑制新合成途径,细胞存活,HGPRT野生细胞株对8-AG敏感,DNA,NMP HGPRT突变,DNA,(三)昆虫突变分析,黑腹果蝇的性连锁隐性致死(SLRL)测试果蝇的体细胞突变分析,(四)哺乳动物活体突变分析,当受试物在微生物或者哺乳动物离体分析中表现阳性结果时方使用，以鉴别其对哺乳动物尤其人类的危险度，其优越之处在于能够体现整体动物对受试物的吸收、分布、代谢、受试物及其代谢物的排泄状况。一般分为：体细胞突变分析 生殖细胞突变分析 转基因动物突变试验,二、染色体畸变测试,(一)染色体结构畸变的检测 A.哺乳动物离体细胞遗传学分析 B.哺乳动物活体细胞遗传学分析(二)染色体数目改变的检测 A.非整倍体检测 B.多倍体检测,三、DNA损伤的测试,A.DNA链断裂B.体细胞重组效应分析(UDS)C.DNA加合物的检测D.DNA修复的检测E.姐妹染色单体交换 F.单细胞凝胶电泳,四、现代分子生物学技术在基因突变检测中的应用,筛查突变的方法主要有二类 DNA片段的突变导致构型改变 单链构象多态性分析 变性梯度凝胶电泳 变性高压液相色谱分析 异源双链DNA错配碱基的检测 化学裂解错配碱基法 酶错配切割法 切割酶片段长度多态性分析,第五节 遗传毒理学的应用,遗传毒物的筛检 环境和人群的监测遗传危害的评价,试验组合的基本原则是能检测五种遗传学终点根据不同的测试对象和目的选择试验组合应包括体细胞和生殖细胞突变试验指示生物应包括几个进化阶段，至少要包括原核细胞与真核细胞两个系统应包括体内实验与体外实验，体外实验应代谢活化系统(S9),遗传毒物的筛检,一些国家新药遗传毒性试验的项目,致突变物的分类标准,判断化合物是否有致突变性的标准,阳性：在检出任一遗传学终点的生物学试验中 呈现阳性反应的物质阴性：需检测五种遗传学终点的一系列试验中 均为阴性 DNA完整性改变 DNA重排或交换 DNA碱基序列改变 染色体完整性改变 染色体分离改变 确定对人具有致突变性还需做流行病学调查,环境和人群的监测,某人群或环境中遗传毒物危害性的鉴定 某人群遗传损伤的直接测试 剂量-反应关系的测定 暴露、遗传毒性效应和生物学后果关系 的评价通过联系和或干扰进行危险度的确定,三、遗传危害的评价,危害识别 剂量反应评定 暴露评定 遗传危险度评定过程中的最后一步是遗传危险度特征描述,