植物组织培养.docx

植物组织培养一、原理植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞,通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，构造疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序构造的一团细胞。二、试剂及仪器（一）仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器（l-5nd）、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶（500mh100ml）.量筒、烧杯（1000ml）、试剂瓶（Iooon11、100ml）、长镶子、记号笔（或标签纸）、培养皿、酒精灯、打孔器（二）试剂75%酒精、次氯酸钠（或H202）、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCLNaOH,KH2P04.CoC12?6H20、烟酸、盐酸-硫胺素（VB1）、盐酸-叱哆醇（VB6）、肌醇、甘氨酸三、实验步骤（一）培养基配制L培养基的选择植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、0、N、P、S、K、Ca.Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu.B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA（呻味乙酸）、IBA（呻味-3-丁酸）、NAA（蔡乙酸）、NOA（蔡氧乙酸）、P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2,4-D（二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（三氯苯氧乙酸）；BAP（羊氨基喋吟）、6-BA（羊基腺喋吟）、2-Zi（异戊烯氨基喋吟）、KT（激动素）等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。培养基种类繁多，最基本、最常用的培养基为MS培养基（见表1）。2.培养基的配制先按表1配制MS培养基贮液，再将贮液与其他成分按比例混合。此外还需参加适量的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉，适量的生长调节剂等。将上述培养基加热溶解后，加蒸偏水使培养基到达终体积。再用0.Imol/LNaOH或0.lmolLHCl调节培养基的pH值至最适。分装至三角烧瓶，封口膜封口，等待灭菌后使用。3.几种诱导愈伤组织的培养基胡萝卜MS+0.5mgL6BA+0.5mgLNAA玫瑰叶盘，芽MS+0.5mgL6BA+0.5mgLNAA烟草叶盘、叶柄MS+O.lmgL6BA+0.5mgLNAApH5.8,蔗糖30%,琼脂粉6.5gLo（二）灭菌1.培养基及器具灭菌培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为12UC,所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化（见表2）灭菌完毕后待温度下降到50。C以下，才能取出已灭菌的培养基。可用同样方法对器具同时开展灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镶子、打孔器等。2.工作环境灭菌接种前Ih打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40mino杀菌完毕后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。3.植物材料的灭菌植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须开展彻底的表面消毒；组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢,再用无菌洁净滤纸吸干水分。推荐阅读：轻松自制精美花盆九月二日：秋麒麟草多年生草本植物毛地黄螃虫的防治及综合介绍