河北医大核医学讲义05体外分析技术.docx

第五章体外分析技术五十多年前，美国免疫学家Pressmen应用放射性碘标记抗原对抗原一抗体免疫反应进行了研究1950年).19531956年间美国生物学家BerSon和YaloW使用放射性碘标记蛋白质，进行蛋白质代谢的实验研究，其间他们发现应用外源性胰岛素治疗的糖尿病患者血清中存在着抗胰岛素抗体。接下来的进一步研究中他们发屈E标记抗原能竞争抑制标记抗原与抗体的结合,并可以从其结合能力检测出未知抗原的量，从而建立了一种新的检测方法(1959年)，这就是放射免疫分析法(radioimmunoassay,RlA)OYalow因此在1977年获得诺贝尔生物医学奖其时BerSon已病故)。1960年EkinS利用血清中的甲状腺结合球蛋白(TBG)和甲状腺素(TT4)具有特异结合的特点，建立了甲状腺素(TT4)的竞争蛋白结合分析(Competitiveproteinbindingassay,CPBA)o1963年Murphy等人进一步完善了这类技术,建立了血浆皮质醇竞争蛋白结合分析。1968年Miles和Hales用放射性核素标记抗体，用过量的标记抗体和待测物反应直接测定待测物的含量，建立了免疫放射分析法(immunoradiometricassay,IRMA)o1970年Lefkowitz在竞争抑制结合反应原理基础上,利用某些激素受体与激素呈现特异结合的特性，以组织受体为结合剂建立了放射受体分析法。其后随着医学科学的进步，出现了应用放射性核素标记配基与特异的受体结合原理，建立了受体的放射配基结合分析(radioligandbindingassayofreceptors,RBA)简称受体放射分析(radioassayofreceptors)o体外放射分析法问世四十多年来，无论是方法学的研究，还是试剂的研制和生产都取得了显著的进步，目前已广泛应用于临床医学诊断和基础医学理论研究中，其检测的物质已达300多种，极大地推动了医学科学的发展，提高了临床诊断疾病的水平。在体外放射分析基础上发展起来的非放射免疫分析技术，如化学发光分析、时间分辩荧光免疫分析等更是以自动化程度高、稳定性好、无放射污染、结果准确等优点，日益受到临床的重视，促进了体外分析技术更加成熟和广泛实用。第一节体外放射分析一、基本原理体外放射分析是指在体外条件下，以结合反应为基础，以放射性核素标记物为示踪剂，以放射测量为定量手段，对体内微量物质进行定量检测的技术总称。包括所有以体外放射分析的基本原理为基础而建立起来的各种体外分析技术,主要包括放射免疫分析、免疫放射分析、受体放射分析等。其方法和种类繁多，不可能也不必全部介绍，本章仅就临床常用的几种体外放射分析技术的原理和方法作一阐述。(一)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay,RlA)是体外放射分析技术中建立最早、应用最广泛的一类技术，其基本原理是利用待测抗原与标记抗原同相应的特异性抗体的竞争结合。在免疫结合反应中，抗原与抗体的结合在一定条件下是呈双向进行的，既能结合成抗原抗体复合物，又可离解为游离的抗原和抗体，这种可逆性结合与多种因素相关。放射免疫分析技术就是在抗原抗体的结合反应中，加入放射性核素标记的抗原，其与有限量的特异性抗体发生竞争结合，这种竞争可以用如下反应式来表达:式中*Ag表示标记抗原，Ag表示待测抗原或标准抗原，Ab表示特异性抗体，*AgAb表示标记抗原抗体复合物,AgAb表示非标记的待测抗原抗体复合物。当这个反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab,而*Ag和Ab是有限量时，则形成的*AgAb复合物的多少取决于Ag的量，随着Ag量的增加，*AgAb的量就会相应减少即与Ag的量呈负相关。当反应达到平衡后揩反应体系中的*AgAb与游离的*Ag分离，测定其放射性。如果在不同试管中分别加入已知系列浓度的标准抗原（Ag）在同样条件参与反应,获得各标准浓度管的*AgAb量（结合率）,并以已知标准抗原的浓度为横坐标，以*AgAb复合物的结合率（如B/T、B/F或F/T）为纵坐标，可绘制出剂量反应曲线，即为标准曲线或竞争性抑制曲线（图5-l)o图5-1放射免疫分析标准曲线这条剂量反应曲线明确反映了剂量与标记抗原抗体复合物之间的负相关关系,有了该标准曲线，则根据待测样品管的*AgAb（结合率）即可刻度出待测抗原的含量。放射免疫分析具有灵敏度高、特异性强、重复性好、准确度高等特点，应用范围广泛，可测物质包括蛋白质、多肽激素、病毒抗原、肿瘤相关抗原、维生素、环磷酸腺昔、小分子物质和某些药物浓度等。（二）免疫放射分析免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）是将放射性核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测抗原结合，将标记的抗体抗原复合物（Ag*Ab）与未结合的标记抗体分离，通过放射测量可求得待测抗原的含量。免疫放射分析标记的是过量抗体,反应系统是非竞争性的全量结合反应,如下式所示：Ag+*AbAg*Ab+*Ab式中Ag表示待测抗原JAb表示标记抗体。当*Ab过量加入反应体系中时，可斗的测抗原全量结合,通过一定手段分离复合物与剩余的标记抗体，并测量复合物的结合率。同样，以已知含量的抗原参与结合反应制作一条标准曲线（即剂量反应曲线，图5-2）通过该标准曲线可以刻度待测抗原的含量，这条标准曲线反映剂量与标记抗体抗原复合物结合率为正相关关系，即复合物的结合率随着待测抗原的含量增加而增加。图5-2IRMA剂量反应曲线免疫放射分析较之放射免疫分析技术具有许多优势，首先IRMA系统中标记抗体，不会改变抗原的免疫活性，而抗体是大分子蛋白，含有多个酪氨酸，标记抗体比标记抗原更容易且稳定；其次IRMA使用过量抗体，反应迅速，应用固相技术容易分离，操作简便；更重要的是，目前越来越多开展的双位点IRMA使用了针对不同抗原决定簇的两种抗体，尤其是采用了纯化抗体或单克隆抗体，避免了交叉反应,特异性和灵敏度(包括测量范围)都大大提高,精密度也优于RIA0双位点夹心法是1971年Addison建立的，其做法是先将抗体包被在固相载体上制成固相抗体，然后与待测抗原结合，生成固相抗体一抗原一标记抗体复合物，溶液中未被结合的剩余标记抗体予以洗去，避免了离心分离的繁琐，检测更加方便、可靠。(三)受体放射分析受体放射分析(radioassayofreceptors)又称为受体的放射配基结合分析(radioligandbindingassayofreceptors,RBA)是目前研究受体亲和力和受体数量最基本、最主要的方法。它是应用放射性核素标记配体与特异的受体结合，测定受体的亲和力和数量，也可用作研究受体亚型的方法。基本方法是用放射性核素标记配体，然后在反应系统中与相应的组织、细胞或含有受体的制剂一起温育，使受体与标记配体充分结合，形成受体一标记配体复合物，终止反应后，采用一定方法分离并去除未被结合的标记物，测定结合部分的放射性，根据加入标记配体的化学量即可计算出待测受体的最大结合容量。如下式所示：<R+*LR*L+*L式中R为受体,*L为已知量的标记配体,R*L为受体与标记配体结合的复合物。受体与配基的结合也服从质量作用定律，对某种受体而言，它的全部都以相同的亲和性以单分子与特定的配基相结合,理论上讲结合后产生的生物效应也应完全相同，尽管亚型的生物效应可能不全相同,结合反应却表现出完全相同的特性。受体与配基的结合并非线性关系，而是曲线关系。配体数量从零开始上升时，复合物数量先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大多数受体都变成复合物，也就是受体被饱和了，形成饱和曲线（图5-3）,曲线的高度主要反映受体的数量，曲线上升的快慢则主要反应受体与配基的亲和力（亲和力越大，上升越快）。图5-3受体数量固定,亲和力固定时,复合物浓度和配基浓度的关系TB代表总结合，SB代表特异结合，NSB代表非特异结合受体放射分析具有灵敏度高,特异性强,专一性好等特点，放射性核素标记配基一般不会改变其结合的生物活性。受体制剂还有多用性，同一组织和细胞上有不同的受体，因此某种组织的制剂可用多种配基作受体结合分析，而且受体的种属选择性不强，人和动物间的受体存在相容性，用动物的受体制剂多数可以用于研究人类的相应配体。二、基本方法体外放射分析有多种类型，无论哪一种类型，其方法都离不开试剂的制备（包括放射性核素标记物、待测物、标准品和结合剂）,反应条件的确定,结合与游离部分的分离,建立标准曲线并刻度出待测物含量等几个基本环节。为了阐述方便，本节主要以经典的放射免疫分析法介绍。（-）试剂的制备L标记抗原或抗体在体外放射分析中，放射性标记物主要是指标记抗原、抗体或配体，不同的分析类型其标记的对象也不同，最常用的标记核素是1251,测量仪器为g计数器，有时也采用发射b射线的3H作标记，但需用液体闪烁计数器测定。对体外放射分析而言,125I是最有价值的核素，其半衰期适中（约60天），既易于商品化与贮存，又有利于废物的处理；"si只发射低能的Y射线（28keV和35keV）,容易测量，辐射自分解小，其标记物有足够的稳定性；另外碘的化学性质活泼,标记容易,设备简单。因此，I?"的标记物在体外放射分析中得到最广泛的应用。对放射性标记物的质量要求主要是四个方面：(1)比活度(specificactivity)比活度越大，表明标记物的用量越小，只有标记物的用量等于或低于被测物的最小量，才能得到较好的灵敏度，标记物的化学用量越小,分析的灵敏度越高,但同时还需使每一反应管中有足够的放射性活度，以减少测量误差，因此高比活度的标记物是确保分析方法灵敏度的前提。但比活度受标记制备方法的限制,而且还应注意每一分子上过多的标记原子会影响标记物的免疫活性和稳定性。(2)免疫活性(immuneactivity)在标记物的标记、储存过程中，许多因素和外界条件的变化都可以造成标记物的损伤，使标记物失去免疫活性。常用的免疫活性检测方法如下：在一组试管中加入一定量的抗体、标记抗原和不同浓度的标准抗原进行反应制备剂量-反应曲线在另一组试管中以不同量的标记抗原(与前一所加的标准抗原量相等)代替标准抗原。如果标记抗原的免疫活性未受损伤，则标记抗原与抗体的亲和能力不会变化，由于是以等量的标记抗原代替标准抗原,两个反应体系的初始抗原总量(包括标记抗原和未标记抗原)和抗体量是相等的，反应达到平衡后的抗体浓度是相等的，由于亲和常数不变，所以B/F值相等，因此两条曲线应该重合。但由于标!己抗原定量的误差，两条曲线常表现为相互平行。如果两条曲线分离或交叉，说明标记抗原的免疫活性受到某种程度的损伤。造成免疫活性损伤的主要因素有：1在蛋白质中引入碘原子代替氯原子时使分子结构发生变化而引起碘化损伤。2标记在蛋白质分子的放射线使蛋白质成为碎片引起放射损伤。3碘化反应时氧化反应和还原反应引起的化学损伤。4随着贮存时间的延长，标记蛋白质的聚合、脱碘等导致标记抗原质量下降。(3)放射化学纯度(radiochemicalpurity)放射化学纯度是指该标记物的放射性活度占标记产物总放射性活度的百分率。一般要求标记物的放射化学纯度在95%以上，若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。(4)稳定性(stability)稳定性是指标记抗原在合理储存的条件下，保持其全部性能不变的程度。许多因素都可以影响其性能的稳定性,如标记方法、标记位置、置换水平，理化环境等都会使放射性核素从放射性标记抗原的分子上脱落下来,或造成标记分子聚合或分离，使放化纯度明显下降。2.结合剂在体外放射分析中，可作为结合剂的主要有抗体、受体和某些蛋白质物质。(1)抗体抗体和抗血清是放射免疫分析中极为重要的试剂，其质量好坏直接影响分析的灵敏度和准确性。传统获得方法是用经过纯化的免疫原在动物身上人工免疫，获得一定的特异血清，分子量超过5000的蛋白多肽类物质具有较好的免疫原性，容易刺激高活度的抗体形成，分子量小于5000的蛋白多肽类物质免疫原性低，需要与载体蛋白结合才能引起明显的抗体形成。而目前应用较多的是采用单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)技术建立放射免疫和免疫放射分析法。利用杂交瘤技术生成McAb获得成功，对医学生物学的很多领域有着极大地推动,其对免疫分析技术的影响主要在以下几个方面提高RIA的特异性。克服了多克隆抗体对众多的抗原类似物存在交叉反应的不足，而单克隆抗体只是针对抗原中的一个特定的决定簇，具有更高的特异性。制备高纯度的抗原。利用McAb高度特异的特点，制备理想的亲和层析柱,可获得高纯度的抗原，而高纯度的抗原又可制备出高效抗血清、优良的标记物和促进标准品的标准化。可以无限量地提供具有高度均一性的抗体。目前，获得人单克隆抗体（HMCAb）的主要途径有：人一鼠杂交瘤获得HMcAb,通过EB病毒（EBV）转化、人一人杂交瘤技术、EBV转化一杂交瘤技术合二为一制备HMCAb、基因工程制备HMcAb等，尤其是后者是获得HMcAb的最好方法。抗体的质量要求：免疫动物产生的抗血清并不能完全适合放射免疫测定，还要对所制备的抗血清进行滴度、亲和力和特异性测定,以满足放射免疫分析需要。滴度测定（titerdetermination）:是评价抗血清质量的一个重要指标，通过滴度测定寻找合适的抗体工作浓度（稀释度）。测定方法是将抗血清稀释成不同浓度，分别加入一定量的标记抗原，在适当的反应条件下达到平衡后，分离结合与游离部分，计算不同稀释度的抗血清与标记抗原的结合百分率，以结合百分率为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标，绘制抗血清稀释曲线（图5-4）,选用标记抗原被结合50%时所对应的抗血清稀释度作为抗血清的滴度（工作浓度）。图5-4抗血清稀释曲编口工作浓度选择特异性：抗体的特异性是指抗体与待测物以外的结构类似物结合的程度。抗体的特异性测定可通过交叉反应率来评价。具体做法是在反应体系中加入被检测的抗血清和标记抗原，此外，分别用被测物和结构类似物为竞争物，制得各自的剂量反应曲线，分别求出结合率为50%时所对应的剂量，按照以下公式计算交叉反应率:其中A50为被测物结合率50%时的浓度值为结构类似物结合率为50%时的浓度值，交叉反应率应越小越好。亲和力：抗体的亲和力与亲和常数（Ka）测定是衡量免疫反应是否牢固的一个重要标准，抗体的质量鉴定中常常需要做亲和常数测定。Ka的测定方法有两种：利用常规RIA中的几个参数代入下式求Ka:式中Bo为零标准管的结合率,EDso和ED25分别为结合率50%和25%时对应的剂量。SCatChard作图法:根据SCatChard函数B/F=Ka×Abo-Ka×B；若以B为自变量,B/F为因变量,则可得一直线方程，其斜率即为-Ka(图5-5)o图5-5Scatchard作图在其它条件相同时，Ka值大的抗体，B/F值大，方法的灵敏度高；另一方面，抗体工作浓度小时,方法的灵敏度高；所以,在选择抗体时应考虑小的工作浓度、强的特异性和合适的亲和力。(2)受体在受体放射分析中，受体在分析系统中起结合剂作用。迄今为止，已发现的受体(receptor)都是有特定氨基酸序列和特定构型的蛋白质。受体主要分为细胞膜受体和细胞核受体两大类，目前，受体的制备需经过细胞匀浆和梯度离心的方法提取和制备。受体与配基的结合具有以下特征：可颜口性(SaturabiIity):每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上的配基将渐趋颜口。特异性(SPeCifiCity)和高亲和力(highaffinity):一种受体只和一定结构的配基发生特异性的结合反应，具有立体异构专一性。可逆性(reversibility):当减少放射配基与受体结合后反应系统中的配基浓度时,则结合的复合物可解离同样加入大量非标记配基时,则可将放射配基置换下来，使放射性复合物减少，说明结合是可逆性的。识别能力(recognition):受体对配基的特异结合具有高度的识别能力。3.标准品(calibrationstandard)标准品是定量的基础,其质量直接影响样品的测定值。对标准品质的要求是：同源同活性高纯度。同源：标准品应与待测物属同一物质；同活性：标准品应与待测物具有相等的活性和亲和力；高纯度：不含有任何可影响分析的杂质。同时，对标准品的量要求精确无误,抗原性制剂提纯后，不能以单纯称重作为定量标准，而要考虑到免疫活性，一般选用经过多次提纯的抗原中免疫活性最高的来定量。(二)反应条件的选择1 .反应方式(1)竞争性结合反应是将待测抗原、标i己抗原和抗体同时加入反应体系,使待测抗原与标记抗原与抗体有相同的反应几率，多数放射免疫分析法为这类反应。(2)非竞争性结合反应也称为饱和分析法。如免疫放射分析中先将待测抗原与抗体在适当的反应体系中充分结合反应，形成抗原抗体复合物，然后再加标记的第二抗体再进行反应，此法可增强待测抗原的结合能力，提高灵敏度。受体放射分析也属于此类反应方式。2.反应介质反应介质是指在反应体系中加入的一些促进反应的物质或益于反应JII页利进行的物质，如缓冲液和一些必需的添加剂。缓冲液可在反应体系中起缓冲作用，针对不同的检测目的，缓冲液的PH值和离子强度都有一定要求，一般以PH值7.47.8为宜，离子强度为0.050.1molL;有些缓冲液中还加入了兔血清和牛血清，以使抗原抗体复合物沉淀更加完全或减少试管对微量抗原、抗体的吸附，保证实验的准确性。添加剂是为了实验的某些目的而加入的物质，如血管紧张素测定时，为了抑制肽类激素的分解，添加抑肽酶、8-羟基噗琳和二疏基丙醇等。3.反应时间和温度反应时间长短与温度有关，反应温度每升高10（不超过37）,抗原抗体结合达到平衡的速度提高一倍，但温度升高会使抗原抗体反应的亲和力下降，而温度过高（60。C）时，则会使抗原抗体失活。因此，就某一种物质的检测而言，反应时间和温度的选择有赖于在不同的温度、时间条件下进行实验对照，以选择最佳的反应条件。（三）分离技术分离是体外放射分析中非常关键的一个技术环节，其目的是将结合部分与游离部分的放射性分离开来。从放射免疫分析技术建立以来，分离方式出现过许多种，从分离技术原理上分类可分为物理分离法（如离心沉淀、活性碳和磁性微粒分离等）、化学分离法（如离子树脂、饱和硫酸镇和聚乙二醇等）和免疫分离法（如第二抗体、蛋白沉淀剂即PR试剂等）；从分离试剂存在的状态上分类可分为液相分离、固相分离等。理想的分离方法主要要求：B和F分离完全：分离技术稳定，受环境因素影响小；非特异性结合低，一般应小于5%;分离试剂来源方便，易于操作。L液相分离技术液相分离的试剂有活性碳、离子树脂、饱和硫酸筱、聚乙二醇、第二抗体、蛋白沉淀剂（PR试剂）等。有些试剂分离效果并不理想，目前最常用、效果最佳的是聚乙二醇（PE加第二抗体的分离技术和在此基础上改进了的PR试剂。2.固相抗体分离技术固相抗体分离技术是将抗体固化在某种支持物上，其最大的优点是快速、简便，非特异性结合率低。用于这方面的支持物可以是纤维素、磁性铁粉、磁性微粒、玻璃微球、乳胶离子或固化在试管壁上等。其制备方式是先将特异抗体包被在支持物上，可以是单纯的物理吸附，也可以通过化学方法将抗体交联在固相材料上制成固相抗体（也用以制成共用的第二抗体的固相抗体），待测抗原和标记抗原与固相抗体一起温育，达平衡时间后，移去反应液，洗涤固相支持物，测量固相支持物的放射性即可求得标记抗原抗体复合物的结合率。这类分离技术目前应用广泛，特别是玻璃小球包被和试管包被，许多IRMA均用此方法分离。（四）标准曲线制作标准曲线（standardCUrVe）是由已知标准含量抗原加入反应体系中制作成的一条剂量反应曲线，它是刻度待测物含量的准则。一般是在反应体系中加入已知抗原（标准品）、标记抗原和抗体，待竞争结合反应达到平衡后，分离结合与游离部分并测量结合部分（B）的放射性，然后计算出B/Bo的百分率（BO为不含已知抗原的最大放射性结合管）。标准曲线以BB0%为纵坐标,已知标准抗原的浓度为横坐标，绘制出BB0%随标准抗原量变化的曲线，这条曲线即为标准曲线（见图5-1和图5-2）。由于BB0%为纵坐标的标准曲线在低剂量区或过高剂量区时误差较大，现已不多用。目前公认以结合率BB0%的Iogit值为纵坐标，以标准抗原浓度的Iog值为横坐标,用最小二乘法对各离散点进行直线回归而得出标准曲线是较好的方法。当然，选用哪种指标和哪种拟合方式还需根据不同检测项目和不同的方法、不同的要求来定。目前已普遍采用计算机进行数据处理，自动绘制标准曲线和直接打印显示样品的含量，操作容易且简便。三、体外放射分析的质量控制(一)误差的来源及分类体外放射分析是一类灵敏度很高的超微量分析技术，许多因素都可能影响分析结果而产生误差。体外放射分析质量控制(qualitycontrol;Qe)的目的和任务就是对分析工作的质量，特别是对分析误差进行经常性的检查，当出现质量异常时及时采取对策，使分析误差控制在可以接受的范围。1 .系统误差(systematicerror)指由于一些可以确定的原因而引起的误差,如仪器故障，试剂变质等。2 .随机误差(randomerror)指由于多种难以确定且无法控制的原因所引起的误差如技术不熟练、设备性能不稳定等。3 .监控方法常用控制方法有准确度(accuracy).偏差系数(CB)、精密度(PreCiSiOn)精密度图(precisionprofile,PP)、反应误差关系(responeerrorrelationship,RER)、平均批变异系数(ABCV)和质控血清样品等(表5-l)o表5-1体外分析误差的分类及来源误差分类常见原因监控方法及标准系统误差仪器故障试剂变质实验方法设计不合理操作程序反常其它系统性干扰因素LCB（偏差系数Bias）CB=（真值-X）/真值×IOO2.准确度准确度=IOO-CB（正常10%）仪器性能不稳定样品采集不当L精密度样品制备不合适精密度=IOO-CV%随机误差试剂配制不准确2.精密度图加样技术不熟练3.反应误差关系（RER）,正常4%分离技术掌握不好4.平均批变异系数（ABCV）,正常4%其它人为干扰因素5.质量控制样品（QC）（二）实验室内质控指标和评价标准实验室内质量控制（qualitycontrolwithinIaboratory）是指在一个实验室内，为保证分析系统能给出可接受和可重复的结果而采用的措施。又分为实验室内批内质控和批间质控。1 .总放射性活度（totalactivity,T）计数误差是导致精密度误差的原因之一，T是反映标记效率的有效指标。一次实验中T小于5000cpm（每分钟计数率）误差较大,提高cpm在50000100000之间精密度增益却并不明显。因此，合适的T值应在1000050000左右。放射性活度计数不能太小。2 .最大结合率（B0%）指没有待测物质存在条件下，标记物与结合剂之间的结合百分率，它是反映结合剂质量的指标之一，一般要求Bo%应大于40%。3 .非特异性结合（NSB%）指在没有结合剂存在的情况下，标记物与其它物质的结合百分率。它的形成受许多因素的影响，如标记物脱落、辐射自分解、缓冲液和分离试剂质量等等。在排除其它因素影响的情况下，它主要反映标记物质量。一般要求NSB%应小于10%o4 .标准曲线的稳定性（1）有效剂量值ED75、ED50.ED25利用这些有效剂量值，可以有效监测标准曲线的稳定性。（2）截距、斜率和相关系数（Iogit-Ig坐标转换）。截距（）:表示零标准管的结合率所对应的剂量值，反映该批测定的最小可测剂量，一般要求尽可能小；斜率（b）:表示该批测定的灵敏度，它与结合剂的亲和常数（K）密切相关，K值越大，检测的灵敏度越高，但斜率过大，可测范围变窄,因此需合理选择，以45。斜率为宜；相关系数（r）:反映各标准管之间的相关程度，其数值应达0.99以上。5 .反应误差关系（RER）RER是反映复管平行性误差的指标。实验反应的误差随RER的增大而增大，呈接近直线的关系，控制这种误差可用RER来衡量，RER一般应4%。RER的计算方法如下是式：A,B为平行管计数6 .平均批间变异（ABCV）是整批实验全部样品（包括标准品及非特异管）的平均反应CV,是整批分析质量评价的参考指标。WHO规定,样品计数变异系数CV%=12%为评价样品精密度的边界值,而一次实验由诸平行样品引起的批平均变异系数则需小于4%。7 .精密度和精密度图（1）精密度（PreCiSion）是指同一样本重复测量中产生相同实验结果能力的统计学指标，是单一结果的可信度。批内精密度：是同一样本一次测量中重复多管的精密度，是长期质控的基线。批间精密度：是表示同一样本在不同的时间内测试结果的重复能力。精密度高，实验结果可信可靠。(2)精密度图(precisionprofile,PP)是用来检测标准曲线可信工作范围的有效方法。具体做法是：以标准剂量各剂量点变异系数(CV%)为纵坐标，以剂量浓度为横坐标作图。CV%在10%以下的曲线范围为可信工作范围(图5-6)。图5-6精密度图8 .准确度和偏差系数准确度是指测定值与真值之间的相符程度，也可用偏差系数(CB)表示。一般CB应小于10。反映测量偏差还可以用回收率测定来表示,回收率高的实验结果可靠。9 .批内漂移监测批内漂移是一种常见而又难以察觉的偏差，迄今为止尚无一种简便有效的监测方法。新版WHO软件提出批内漂移t检验，可对批内漂移监测起到一定作用。10 .分离技术误差监测结合与游离部分分离时的误差常常源于两个方面：一是离心设备，离心力和离心时间等对分离效果的影响；二是分离方法和试剂及分离试剂加样量误差对分离效果的影响。对常规临床工作而言，分离技术的质量控制，主要是控制实验条件和试剂加样量。若遇药盒Bo%低,NSB较高,又为乙醇或硫酸铁等分离时，分离试剂的加样量一定要准确，而免疫学方法分离时，分离试剂的用量则对结果影响不大。11 .Shewart质控图（又称LeVey-Jen-NingS作图法）Shewart图是一种利用质量控制血清样品值作图的实验误差检测分析方法,是临床检验误差常用的批间才旨标之一（图5-7）图5-7Shewart质控图（第13次检测时高低值QC均超过检测范围）SheWart质控图有两种评价标准：一是允许有5%的点超出±ISD,1%的点超出±2SD（n=20时）;另一种标准是,在同一方向不多于3点超出±1SD,同一方向不多于2点超出±2SD和不允许超过±3SD存在（n=10时）。（三）实验室间常用质控方法实验室间质量控制（interlaboratoryqualitycontrolorqualitycontrolbetweenlaboratory）,是为了评价单个实验室的特征，并减少实验室间的偏差和改进实验室之间的精密度，由统一的机构所采取的统计学方法和措施。具体措施多采取下述几类方法：L利用统一发放的QC测定值制作质控图，方法同PP图。监测测定结果的精密度和曲线的可用范围，宏观分析单个实验室和某一地区的精密度。2 .利用统一发放的QC测定值作Shewart图，用以评价单个实验室检测误差或某一地区的准确度。3 .优化标准曲线的拟合方式和其他手段。第二节非放射标记免疫分析体外放射分析技术以其灵敏度高、特异性强、结果准确可靠，得到了广泛应用。但是，也存在难以自动化分析、分析时间较长、不适宜急诊检测、由于放射性衰变使得试剂的货价期短等缺点。几十年来，人们不断探索和研究，希望能够寻找到既能克服放射分析不足,又能保持体外放射分析的高灵敏度和特异的分析方法。20世纪90年代开始在体外放射分析技术的理论基础上建立起来的一些非放射标记的免疫分析技术，如酶免疫分析、荧光免疫分析、化学发光分析、时间分辨分析及电化学发光分析等相继问世。尤其是后两种技术分析操作简便、灵敏度及稳定性好、自动化程度高、出结果快,试剂至少可以存放半年以上,是医学超微量检测技术的一次革命。但这些非放射分析技术的主要缺点是分析成本较高。这里仅简要介绍化学发光免疫分析和时间荧光分辨免疫分析。一、化学发光免疫分析化学发光免疫分析，可以分为直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。目前应用最多最广泛的是直接化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析。(一)直接化学发光免疫分析(chemiluminesceimmunoassay,CLIA)直接化学发光是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化形成一个激发态的中间体，当激发态的中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，测定光子产额可用以定量被测物的数量。实际上CLIA包括免疫反应系统和化学发光反应系统两个部分。目前常用的标记化学发光物质主要是口丫陡酯类化合物(acridiniumester,A)oAE是一类发光效率较高的化学发光剂，将其标记于抗原或抗体上,通过启动发光试剂(NaOH-H2O2)z在1秒种内产生强烈、快速的闪烁发光；经光密度测定仪可以测定出被测物的含量,其灵敏度可达10-mo根据分子大小CLIA可以分为两种：测定小分子抗原采用竞争法；大分子抗原采用夹心法。夹心法非特异性结合少，本底低，与大小分子结合不会减少所产生的光亮，从而增加灵敏度。(二)电化学发光免疫分析(electrochemiluminesce,ECL)电化学发光免疫分析是继直接化学发光分析技术之后出现的一种新的发光分析技术。电化学发光的反应在电极表面进行，发光底物为三联口比陡钉(Ru(bpy),用三丙胺(TPA)来激发光反应，在阳极表面，这两种物质可同时失去电子，发生氧化反应。在电极板上二价的(Ru(bpy)口)迅速被氧化成三价Ru(bpy),与此同时TPA也在电极板上被氧化成阳离子自由基(TPA+*),(TPA÷*)自发地释放一个质子而变麻潟定分子(TPA*)将T电子传递给Ru(bpy)形成激发态的Ru(bpy)*。Ru(bpy)口*在衰减时发射一个波长为620nm的光子，重新回到基态Ru(bpy)o这一过程在电极表面反复进行,产生高效、稳定的连续发光,并不断增强。ECL和CLA的主要区别在于标记物不同:一般的化学发光分析是标记催化酶(如辣根过氧化物酶、微过氧化物酶等,又称间接化学发光免疫分析)或标记化学发光分子(如鲁米那、口丫陡酯等),这样的发光反应一般发光不稳定，为间断的、闪烁性发光，而且在反应过程是易发生裂变,导致反应结果不稳定。此外，检测时需对结合相、游离相进行分离，操作步骤多，测试成本较高。而ECL则不同，为电促发光，它所采用的发光试剂标记分子是联口比咤钉Ru(bpy)口。Ru(bpy)在三丙胺阳离子自由基(TPA+)的催化以及三角形脉冲电压激发下,可产生高效、稳定的连续发光，同时，由于Ru(bpy)口在发光反应中的再循环利用使发光得以增强、稳定，而且使检测步骤大简化，也更易于自动化。二、时间分辨荧光免疫分析早在1941年荧光抗体已应用于免疫组化技术，但由于荧光本底高和荧光易淬灭等问题,使得荧光免疫测定发展迟缓。1983年Soini和Kojola用新型的荧光物质作为标记物建立了时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluorescentimmunoassayzTrFIA)o其基本原理是利用具有双功能基因的三价稀土离子(如铺系元素)及其螯合物作为示踪剂标记抗原,其被激发后产生的荧光寿命比一般荧光长,因此可待短寿命的本底荧光衰退后再进行测量(即所谓延迟测量),减少干扰提高灵敏度和准确度。镯系元素本身对能量吸收较低发出荧光也较弱。当与某些有机配体(螯合物)结合后，经紫外光或激光激发，才能有效地吸收激发能量，将能量传递给镯系离子，显示强的离子荧光。镯系元素最常见的螯合剂为多氨基、多羟基类螯合剂，有乙烯三氨基五酸酊(DTPAA)等,这是一种溶解度高、稳定性好、螯合能力强的双功能螯合剂。三价的镯系元素中Eu3+、Sn3+、Tb?+、和Dy3+发射的离子荧光最强,Eu3+最为常用,Sm3+则多用于双标记测定。铺系元素的荧光有两个特性：1镯系离子结合上有机配体（螯合剂）后，其荧光信号的寿命比特异的本底荧光要高出几个数量级。EiP+在501000s间，Sm3+为1050s,而非特异荧光仅为O.Ols02所发射的荧光谱示：发光谱的激发峰与发射峰之间有较大的峰移和上徽窄的发射峰,一般峰移可大于200nm,其激发峰谱在305340nm,而发射光谱则不同，EiP+为613nm,Sm3+为597nm0Ei?+等铺系元素作为标记的时间分辨荧光免疫分析具有以下特点：1标记技术如同放射免疫分析一样，也属原子标记技术，但为非放射性,对被标记物损伤小，稳定性好，药盒寿命远长于RIA,可达1年。2 .测量原理为延迟测量，彻底地清除了非特异荧光本底的干扰，被誉为零"本底测定,在规定的测量时间内，实际荧光测定达1000次之多,故其灵敏度比其它非放射性标记免疫分析为高,特异性也好。3 .由于可应用的镯系元素有Eu、Tb.Sm.Dy等四种之多，且其荧光信号的寿命长短各异,因此有利于制备双标记试剂盒,提高检测的灵敏度方便临床应用。4 .目前的全自动非放射标记免疫分析技术，几乎全部都是封闭试剂，而TrFlA是唯一的开放型仪器，对各种时间分辨荧光免疫分析试剂均可兼容，有利于试剂盒的实验室研制和国产化。第三节体外分析技术的临床应用体外分析技术在临床上的应用十分广泛，几乎涉及临床医学的各个领域，其检测项目达数百种之多，成为医学研究和临床诊断必不可少的重要手段。与核医学有关的常用体外分析指标可以大致按疾病系统分为甲状腺及甲状旁腺激素与自身抗体系列、性腺及生殖激素系列、肝胆及胃肠激素系列、肿瘤标志物系列、心血管激素系列、肾脏功能系列、肾上腺激素系列、血液疾病及免疫功能系列等。附录一列出了常用的体外分析项目、参考正常值和临床意义。（杨军）索引radioimmunoassay,RIA放射免疫分析immunoradiometricassay,IRMA免疫放射分析技术radioassayofreceptors受体放射分析radioligandbindingassayofreceptors,RBA受体的放射配基结合分析titerdetermination滴度测定monoclonalantibody,McAb单克隆抗体calibrationstandard标准品standardcurve标准曲线qualitycontrol;QC质量控制systematicerror系统误差randomerror随机误差responeerrorrelationship,RER反应误差关系precisionprofile,PP精密度图qualitycontrolwithinlaboratory实验室内质量控制qualitycontrolbetweenlaboratory实验室间质量控制chemiluminesceimmunoassay,CLIA直接化学发光免疫分析electrochemiluminescezECL电化学发光免疫分析time-resolvedfluorescentimmunoassay,TrFIA时间分辨荧光免疫分析