流式细胞术及其临床应用.pptx
流式细胞术原理及临床应用,流式细胞仪(Flow Cytometer)是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器；当细胞（或其他粒子）以单个方式依次通过探测光束时，能够采集细胞被光照时产生的各种信号，然后对信号进行处理，并能对多个参数进行关联分析的一种仪器流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术,流式细胞术,流式细胞术,激光技术、计算机技术、显微荧光技术、光电子技术、流体喷射技术、单克隆抗体技术、纳米技术以及分子生物学和免疫学等多门学科知识现代科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体的“大成者”广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科领域20世纪70年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由基础研究进入到临床检验医学领域，为细胞分析提供全新手段,1930 Caspersson&Thorell 细胞计数,1940 Coons结合荧光素的抗体去标记细胞内特定蛋白,1934 Moldaven细胞检测自动化光电仪记录流过一根毛细管的细胞数,1950 Caspersson显微分光光度计UV-VIS光谱区检测细胞,1953 Croslannd Taylor根据分层鞘流原理成功设计红细胞光学自动计数器,1969 Van Dilla及同事在Los Alamos,NM发明第一台荧光检测细胞计,1972 Herzenberg荧光激活细胞分选仪荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号,1975 Kohler单克隆抗体为细胞研究提供大量的特异免疫试剂,流式细胞术发展史,1973 BD公司与斯坦福大学合作第一台商用流式细胞仪,分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选,流式细胞仪的分类,计算机与分析系统,信号收集与光电转换系统,流动室与液流系统,光源与光学系统,流式细胞仪构造,激发光源,计算机分析,滤光片,流动室、鞘液和样本流,信号检测器,激发光源光学系统,细胞分选与浓缩系统,（一）流动室与液流系统,流动室是流式仪核心部件，被测样品在此与激光相交流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息,（一）流动室与液流系统,液流驱动系统,（二）激光光源与光学系统,（一）激发光源：激光器 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有Rhodomin 6G水溶液染料，发出550-650nm可变波长激发光；半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长；BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照,（二）激光光源与光学系统,（二）光束成行系统,（二）激光光源与光学系统,透镜,（二）光束成行系统,滤光片的组成长通(Longpass，LP)滤片：只允许特定波长以上的光束通过短通(Shortpass，SP)滤片：只允许特定波长以下的光束通过带通(Bandpass，BP)滤片：只允许一定波长范围内的光束通过,（二）激光光源与光学系统,（三）光收集系统,（二）激光光源与光学系统,（三）光收集系统,480 520 460 500 540,480 520 460 500 540,光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数前向散射光(forward scatter,FSC)侧向散射光(side scatter,SSC)荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍,（三）信号收集和光电转换系统,（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小,（三）信号收集和光电转换系统,（二）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。,（三）信号收集和光电转换系统,R1:淋巴细胞 R2:单核细胞 R3:中性粒细胞 R4:裂解碎片,（三）信号收集和光电转换系统,外周血裂红后FSC/SSC分布,（三）荧光信号荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光,（三）信号收集和光电转换系统,基态,（三）荧光信号细胞经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测就能了解所研究细胞参数的存在与定量,（三）信号收集和光电转换系统,（三）荧光信号常用荧光素,（三）信号收集和光电转换系统,能量传递染料,（三）荧光信号常用荧光素,（三）信号收集和光电转换系统,能量传递染料(PE-Cy5 PE-Cy7 PerCp-Cy5.5)用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生荧光信号，最终检测第二荧光染料发射的特定荧光信号,（三）荧光信号,（三）信号收集和光电转换系统,499nm：蓝色荧光（Blue）500-549nm：绿色荧光（Green）550-584nm：黄色荧光（Yellow）585-615nm：橙色荧光（Orange）616-700nm：红色荧光（Red）700nm：远红外荧光（Far-Red）,（三）荧光信号,（三）信号收集和光电转换系统,目前常用FCM配置（BD Calibar）488nm激光管常用染料有第一通道（FL1）：FITC(Fluorescein Isothiocyanate)第二通道（FL2）：PE(Phycorey-thrin)第三通道（FL3）：PerCP(Peridinin Chlorophyll Protein)PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5633nm激光管常用染料有第四通道（FL4）：APC多色标记荧光素搭配原则 每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC,面积（A）：荧光总量高度（H）：最大荧光强度宽度（W）：细胞直径,光信号到电脉冲信号,FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统,（四）计算机和分析系统,FCM数据显示方式,单参数直方图(Histogram)双参数数据显示：散点图(Dot Plot)伪彩图(Pseudo-color Plot)等高线图(Contour Plot)密度图(Density Plot)假三维图(Pseudo 3D Plot)三维图(3D Plot),常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCS Express,直方图（Histogram）,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数,Counts,FITC荧光强度,（四）计算机和分析系统,直方图（Histogram）,（四）计算机和分析系统,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的,DNA倍体分析,抗原表达分析,Overlay图,散点图(Dot Plot),（四）计算机和分析系统,散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观,散点图(Dot Plot),（四）计算机和分析系统,散点图 伪彩图,等高图和等密度图,（四）计算机和分析系统,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,（四）计算机和分析系统,假三维图和三维图,门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程,椭圆形,圆形,设门与数据分析,（四）计算机和分析系统,矩形,任意形状,R(Region，区域)：门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合在一起：G=R1 and R2;G=R1 or R2;G=R1 not R2,（四）计算机和分析系统,十字门,线性门,（四）计算机和分析系统,流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,流式细胞仪特点,目前国内主要流式细胞仪厂家,Beckton Dickinson(BD),BACKMAN COULTER,Epics XL 单激光四色，分析型,CyAn三激光九色，分析型,FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率较高，分析型,Gallios 三激光十色，分析型,MoFlo XDP 高端分选型,Beckman Coulter公司流式细胞仪,BD公司分析型流式细胞仪,FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高,FACS Canto II 双激光六色，三激光八色,FACS Verse双激光六色，三激光八色,AccuriC6 双激光四色,BD公司分析型流式细胞仪,LSRFortessa X-20 五激光十八色，分析型最高配,LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色,FACSVantage SE,FACSAria III,Influx,BD公司分选型流式细胞仪,BD FACS Canto II,双激光或三激光，8色分析 八角形/三角形光信号接受系统，利用全反射的光路结构设计，避免透射过程对光信号的损耗，提高荧光灵敏度 兼顾科研需求和临床检测BD FACSTM 7-color setup beads使体外诊断中所有实验的日常仪器设置在一管中进行专门配备有FACSCanto临床软件，淋巴细胞亚群，HLA-B27等临床自动检测和分析软件，直接报告检测结果独立液流车系统，保持液流的稳定 最小样本量：30微升手动上样/自动连续上样获得SFDA认证,BD LSRFortessa X-20,提供5激光，18色分析18种波长的激光器，横跨从紫外到红外全光谱范围，提供灵活的光谱选择满足高端科研需求,淋巴细胞亚群 HLA-B27CD55、CD59检测CD34造血干细胞计数白血病和淋巴瘤免疫分型TH1/TH2细胞检测血小板活化炎症感染指标CD64网织红细胞/血小板检测微小残留病灶（MRD）肿瘤细胞倍体（DNA）细胞凋亡,流式细胞术的临床应用,标本的种类：血液、骨髓穿刺液、各种体液（胸水、腹水、脑脊液）、组织（如淋巴 结、肝、脾）及肺泡灌洗液等抗凝剂：外周血：EDTA、肝素和枸橼酸均可 骨髓：肝素（推荐）、EDTA 血小板：枸橼酸储存时间：EDTA：2448h 肝素：4872h 枸橼酸：72h严重溶血、凝血或坏死的样本应弃用,单细胞悬液,标本要求,淋巴细胞亚群分析,试剂：BD Multitest IMK Kit标本：外周血（常用）配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC检测指标：T细胞（CD3+CD4+、CD3+CD8-）B细胞（CD19）NK细胞（CD3-CD1656）,临床意义反应体内免疫状态CD4+T降低：病毒感染、恶性肿瘤、免疫缺陷病、免疫抑制剂使用CD8+T增高：病毒及结核杆菌感染，自身免疫性疾病活动期、肿瘤、慢性活动性肝炎CD4/CD8降低：处于免疫抑制状态免疫缺陷病：如艾滋病时的比值常显著小于0.5某些恶性肿瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等某些病毒感染：HBV、EB、CMV等NK细胞（CD3CD16+和/或CD56+）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用,淋巴细胞亚群分析,淋巴细胞亚群分析,HIV感染者,HLA-B27检测,试剂：BD HLA-B27 Kit 标本：外周血检测指标：T(CD3+)淋巴细胞上HLA-B27定性检测,临床意义：强直性脊柱炎（高度相关，90%）Reiters 综合征（70-90%）银屑病关节炎（50-60%）急性前葡萄膜炎（40-50%）,HLA-B27检测,PNH诊断,试剂：CD59-FITC、CD55-PE 标本：外周血检测指标：CD55、CD59百分比 CD55、CD59荧光强度,阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH,Normal,PNH,PNH诊断,造血干细胞计数,试剂：BD Procount Progenitor Cell Enumeration Kit标本：骨髓、动员后的外周血配色：CD34-PE、CD45-PerCP、nucleic acid dye检测指标：CD34及浓度,蓝色荧光微球（数量已知）；红色CD34细胞,干细胞特征：CD45表达弱阴性(R2)CD34表达弱强(R4)DNA/RNA含量多，染色性较强(R1)大小（FSC）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似,临床意义：血液系统疾病的造血干细胞移植 数量的检测 采集时机的确定,造血干细胞计数,白血病和淋巴瘤免疫分型,试剂：各种单克隆荧光抗体标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织,分型方案：CD45设门，四色标记，临床意义：客观、快速地分析 确定异常细胞系来源及分化阶段 判断预后,白血病和淋巴瘤免疫分型,正常骨髓细胞CD45/SSC,R1:淋巴细胞R2:幼稚细胞R3:单核细胞R4:中性粒细胞R5:有核红细胞,AML-M1,R2占94，表达CD33,CD34,CD117,CD71,CD13,CD64,MPO,ALL(B),R2占65，表达CD79a,CD19,CD34,CD22,CD10,CD38,HLA-DR,临床意义：CD4/CD8 结节病 特发性肺间质纤维化 肺部肿瘤疾病,CD4/CD85.04,Th1/Th2细胞检测,Th2，蠕虫感染 环境变应原的应答 IL-4、IL-5、IL-10等 介导体液免疫,TH1/TH2细胞检测,细胞内细胞因子表达 IFN-（Th1）和IL-4（Th2）检测前需要刺激活化（PMA+ionomycin）46h Golgistop，含有莫能霉素（Monensin）设门策略：CD3+CD8-,TH1/TH2细胞检测,感染性疾病CD64检测,CD64：FC受体 单核细胞（）中性粒细胞（dim）淋巴细胞（）检测指标：中性粒细胞CD64表达强度 CD64指数CD64中性粒/CD64淋巴临床意义：细菌感染、脓毒血症、败血症,感染性疾病CD64检测,CD45,CD64,CD64,CD64,CD64,液相芯片技术CBA,CBA：Cytometric Bead Array 可溶性蛋白：血清中细胞因子 荧光微球连结特异抗体 不同荧光强度 多个检测指标标本：血清、血浆、培养液、各种体液,液相芯片技术CBA,液相芯片技术CBA,思考题,1、FSC和SSC分别分别反应了细胞的什么特点？2、外周血淋巴细胞亚群分析的临床意义？,Thank you！,
