不同温度对单链寡核苷酸分析的影响.docx

治疗性寡核甘酸的纯化及表征是目前制药行业的一大热点。然而，寡核昔酸的表征，特别是通过离子对反相液相色谱(IP-RPLC)进行表征，可能会非常具有挑战性。治疗性寡核甘酸是通过固相合成制造，也就是核普酸以特定合成步骤进行循环。因此，我们必须对n-1和n+1等杂质进行表征，这其中可能需要大量的方法开发步骤来进行优化。此外，我们可能还需要对其他密切相关的杂质进行表征和定量，例如硫代磷酸酯的氧化。另一个挑战是在寡核昔酸分析中可能会观察到的色谱的变化。保留时间、峰形和峰面积回收率可能在一个序列的进样之间变化。这些变化的一个可能原因是有会影响色谱性能的分子内相互作用。因此，我们通常会采用超过60°C的高温来改善分离。虽然这是处理双链寡核昔酸(如siRNA)时的基本要求，但单链寡核甘酸是否也有必要在高温下分析是一个值得讨论的问题。在此技术笔记中，我们展示了温度对两种寡核甘酸，一种5'共朝寡核甘酸和一种硫代磷酸酯，的影响，以及如何将其用于单链寡核普酸的方法开发过程。图1说明了以5°C为增量增加方法运行温度的效果。和其他色谱方法类似，5匚氨基C12寡核甘酸的保留时间随着温度升高而减少。通常，效率和峰形在更高的温度下会得到改善，但是在本示例中没有观察到这一点。此外，在比较45°C和65°C的杂质分布时，图中几乎没有显示出明显差异。因此，人们可能会得出结论，选择性没有受到温度的影响。为了更好地确认选择性变化，需要使用质谱来识别和表征杂质峰。具有未知序列的22mcrDNA硫代磷酸酯通过高分辨率MS进行分析。硫代酸盐的测量质量为6772.6Dao我们在不同温度下进行寡核甘酸的分析，以观察杂质分析选择性的变化。在比较60和70°C下运行的方法时（图2）,如预期所示，在较高运行温度下，主峰的保留显着降低。然而，两种方法都给出了相似的杂质谱。我们观察到了三种较早洗脱的杂质。解卷积质谱证实了相同的洗脱顺序。杂质峰1为6443.4Da,峰2为6468.4Da,峰3为6170.8Da。两种运行条件下峰1的解卷积光谱如图3所示。有趣的是，峰1和2可能都是口一1杂质，峰1是目标序列减去鸟昔，峰2是目标序列减去胸普。总的来说不同温度通常用于寡核甘酸分析的方法开发。然而，对于单链寡核甘酸，在超过60的温度下运行可能并没有太大提升。因为温度的升高可能不会改善色谱分离，也不会影响选择性，正如我们在其他大分子中观察到的一样。液相色谱条件色谱柱：bioZen2.6mOligo规格:IOOX2.1mm（图1）00D-4790-AN150X2.1mm（图2,3）00F-4790-AN流动相：图1:A: 12.5mMHFIP,4mMTEA水溶液B: 12.5mMHFIP,4mMTEA甲醇溶液图2,3:A: 100mMHFIP,4mMTEA水溶液B: 100mMHFIP,4mMTEA甲醇溶液梯度：5-30%B于14分钟内（图1）25-95%B于15分钟内（图2,3）流速：0.3mLmin进样量：IUL温度：如图所示检测器：UV260nm（图1,2）TOF-MS（图3）样品：5J氮基C12寡核甘酸（图1）DNA22mer硫代磷酸酯（图2,3）«c45C5055OC60-C65gesz9ddv1012.515Tm>>.nin温度对5二氨基C12寡核甘酸的影响8693O- Qa<图2：22merDNA硫代磷酸酯的杂质谱图ZCBSZQ- &<图3：杂质峰1的解卷积谱图