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2022体外胎盘小叶灌流模型的研究进展（全文）胎盘是母体循环和胎儿循环的分隔，为胎儿提供一个相对稳定而不易受母体内环境影响的状态；同时运输营养物质，为胎儿提供养分。胎盘这种有选择的过滤作用，一直以来都被认为是保护胎儿的屏障。但20世纪50年代，沙立度胺（反应停）大灾难宣告胎盘这一保护屏障并非牢不可破，提示胎盘也有转运有害物质进入胎儿循环的潜在风险。因此对胎盘转运机制的研究非常重要。长期以来，对胎盘转运机制的研究从未停止。使用动物模型成为首选方法，但种族间胎盘形态学和功能的差异，导致动物实验得出的结论缺乏可信度。为了有效研究胎盘屏障的作用，同时符合伦理学原则，体外胎盘小叶灌流模型（简称灌流模型）应运而生。该方法最早由Schneider等建立,后经不断改进和创新，现已成为应用最多的研究胎盘屏障对内源性或外源性物质透过特性的方法。现就灌流模型的原理、方法及研究进展进行综述。一、灌流模型的原理胚囊着床后，滋养细胞侵袭子宫内膜形成初级绒毛，胚外中胚层和中胚层依次深入绒毛干形成次级绒毛和毛细血管，建立胎儿循环。子宫螺旋动脉破裂直接开口于绒毛间隙，间隙内充满了母体血液。胎盘使母体循环与胎儿循环在互不相通的情况下，仍能以极大面积进行物质交换，保证胎儿生长发育所需。胎盘的主要功能包括代谢、防御、合成及免疫2。相邻绒毛间隙之间残留的楔形蜕膜形成盘隔，把胎盘的母体面分隔成数个胎盘小叶。胎儿面被羊膜覆盖,脐动、静脉从附着处向四周呈放射状分布，其分支进入绒毛树2。灌流模型是取1个或几个邻近胎盘小叶，在体外重新建立胎儿面和母体面的体液循环，模拟胎盘生理状态。灌流方式可分为开放式和闭合式。开放式灌流指灌流液只流经胎盘1次，优点为进液中的物质浓度较为稳定，可根据进出入胎儿面的灌流液浓度改变量准确计算出该物质的胎盘清除率；缺点是对待测物质经胎盘转运速度要求高，如果转运速度慢，易出现测不出结果的情况1。闭合式灌流指灌流液流出之后又回到起始池，多次循环流经灌流模型，优点是需要的灌流液量少，对物质浓度稳定性和其经胎盘转运速度要求低，对于转运速度慢的物质，也可绘制出时间-浓度变化曲线，直观描述物质通过特性3。二、灌流模型的建立1 .灌流液的配比：灌流液的配比应兼顾模拟生理情况、实验可行性和经济性等方面要求。主要特点有：(1)对细胞温和不刺激，张力稳定：可选择的有E1.ar,s液、KRB(Krebs-Ringerbicarbonatebuffer)干粉配液及M199组织培养基等4。(2屈给细胞足够能量:可加入葡萄糖12g/1.,还可适量加入能使细胞保持活性的物质，如右旋糖酊T40或谷氨酸5。如果模型使用时间5h,则需加入一定量的细胞培养液4。(3)稳定的pH值：理想范围为7.357.450(4)抗凝：可加入浓度为5-25U/m1.的肝素钠6。(5)抗菌：加入青霉素、链霉素，也可加入卡那霉素等。如果不加入抗生素，150min后细菌会大量繁殖，与细胞抢食”养分，且细菌的代谢产物会使PH值和氧分压下降，影响模型活性和实验结果6。(6)人血清白蛋白(humanseruma1.bumin,HSA):如果测试物质为脂溶性则在体内会与HSA结合故需加入HSA才能正确模拟体内状况。有研究报道，加或不加HSA,同一种物质会有完全不同的通过率5。此外，灌流液中要充入适量氧气，使细胞保持活性。配好的灌流液于37水浴箱预热，灌流过程需维持此温度。2 .胎盘标本的选择阴道分娩或剖宫产的胎盘均可选择。依研究目的不同，所选胎盘可以不同。常用的胎盘选择标准为：(1)正常妊娠、无妊娠合并症或并发症。(2)胎盘完整无裂伤。(3)新生儿Apgar评分正常，脐带血气正常6。3 .胎盘标本的处理：观察胎盘的胎儿面，选取脐动、静脉并行且走行清晰的1个区域。先对脐动、静脉干进行插管，再把此脐动、静脉干辐射区的胎盘小叶取下，大小为46cmo注意尽量在血管走行外留12cm宽的边缘,以防取下的胎盘小叶漏液1。再对取下胎盘小叶的母体面进行插管,位置与胎儿面的脐动、静脉干相对应，灌流针刺入胎盘间隙0.51.0cm,插管24根1。灌流针安装成功后，开启蠕动泵，将灌流液输入灌流模型。4 .灌流速度：妊娠末期,胎盘母体面和胎儿面的液体流速一致。但灌流模型中，母体面和胎儿面的有效灌流面积不一致，故要求母体面灌流压力大于胎儿面。母体面灌流速度为8-15m1./min灌流压力为70-140mmHg(1mmHg=0.133kPa);胎儿面灌流速度为3-12m1./min,灌流压力为50120mmHg1.o5 .灌流时间：灌流总时间为24h,包括冲洗和缺氧平复期、控制平衡期和实验期6。灌流时间过长会导致细胞死亡脱落，使胎盘屏障变薄，失去代表性。但也有研究报道灌流时间长达48h6o需要注意的是,尽管灌流会引起组织水肿等形态学改变，但细胞的活性却通常能保持较长时间，形态学改变并不意味着灌流模型的结果不可信。三、灌流模型的常用检测与评价方法1 .漏液量:漏液量为胎儿面循环液体进入母体面循环或漏出灌流模型的量，即胎儿面循环的起始液量与灌流终止时剩余液量的差值。漏液量是检测体外胎盘小叶灌流模型成功与否的金标准。如果漏液量3m1./h,可认为此灌流模型成功。2 .氧分压及PH值：每30min监测胎儿面和母体面灌流液中的氧分压及PH值。胎儿面氧分压应保持在1015kPa,母体面为2535kPaoPH值保持在7.357.45,也有研究认为可放宽至7.37.54.3 .安替比林的透过特性：安替比林为一种解热镇痛药，可通过抑制环加氧酶参与前列腺素的合成代谢。安替比林为脂溶性，以被动扩散方式通过细胞膜，其转运速度是胎盘膜转运功能的特异性指标,因而可作为一种流速限制性物质用于灌流模型。BrandeS等9研究发现，安替比林在循环中表现出一级动力学的清除特征，转运速度随着灌流速度的不同而变化。胎儿面与母体面灌流速度的比值增大，有效交换面积增大，安替比林的清除率就增大，当该比值二I时，清除率达到峰值。安替比林的清除率与时间无显著相关性，也不受起始浓度影响。也有研究认为，可用安替I:匕林胎儿面和母体面的浓度比值衡量灌流模型是否成功，在母面加入安替比林灌流2.5h之后，该比值必须0.75,才考虑灌流模型成功。因此，安替比林可作为灌流模型透过性的质量控制指标，也是评价灌流模型成功与否的指标之一4,8。四、灌流模型的应用迄今为止，灌流模型已被广泛用于研究胎盘屏障对多种内源性和外源性物质的透过特性，如糖、氨基酸、脂肪酸、维生素和胰岛素等，也用于研究各种药物及体内外环境因子的透过特性。因为妊娠期母体暴露因素对胎儿会产生影响，多数研究关注物质从母体面向胎儿面的转运特点，即在母体面灌流液中加入待测物质，监测胎儿面灌流液中待测物质浓度变化。目前研究最多的是药物是否可通过胎盘屏障,以便指导妊娠期安全用药。研究显示，可通过胎盘屏障的药物包括:(1)部分致瘾性药物：可卡因及其衍生物、吗啡、尼古丁、可替宁和美沙酮等10o(2)部分人类免疫缺陷病毒抑制剂：齐夫多定、洛匹那韦、利托那韦和马拉维若等口0-12。(3)部分麻醉药物：麻黄碱、利多卡因、布比卡因、芬太尼和舒芬太尼等10。(4)部分抗癫痫类药物：奥卡西平和卡巴咪嗪等10。(5)部分抗生素：环丙沙星和氧氟沙星等10。(6)其他：水杨酸类药物13和地高辛10等。不能通过胎盘屏障的药物包括：人类免疫缺陷病毒抑制剂沙奎那韦10、抗生素万古霉素口4及抗癫痫药物镁天东氨酸盐15等。此外，研究发现，抗糖尿病药物如罗格列酮、格列本版等的胎盘屏障透过率极低，可视为不转运16-17。但如果在灌流液中加入HSA,罗格列酮的透过率升高，而格列本版的透过率降低18。此外，应用右旋糖酊等使胎盘保持循环活性和功能的药物，可能为胎儿生长受限的治疗提供新思路19。环境因素也是研究的重点，环境中存在的苯甲酸、咖啡因、草昔磷、丙烯酰胺、环氧丙酰胺、苯并茂、丙二酚和木黄酮等物质可通过胎盘从母体转运至胎儿5,20-23,提示妊娠期暴露于这些因素可能会增加胎儿畸形的风险。有研究者利用灌流模型研究物质从胎儿向母体转运的透过特性，以帮助阐明某些妊娠期疾病的发病机制。May等24在胎儿面灌流液中加入子痫前期患者血浆内高水平的胎儿游离血红蛋白，造成胎盘灌流压上升和母体面胎儿游离血红蛋白水平上升，模拟与子痫前期相似的生理病理改变。但若在母体面同时加入a1.微球蛋白则可阻止胎儿游离血红蛋白由胎儿面向母体面转运，并影响母体面组织形态学和氧应激等相关基因表达的改变，提示胎儿游离血红蛋白可能在子痫前期发病中扮演重要角色，而C(I微球蛋白可能成为一种新药物用于治疗子痫前期。五、不足与展望灌流模型的建立，解决了使用动物模型不能推论于人体的缺陷，也在很大程度上规避了直接进行人体实验的伦理道德限制，但仍然有一些不足之处。所取标本为妊娠晚期胎盘，由于细胞脱落和母体内环境的改变,妊娠早期和中期胎盘转运特点并不能得到很好解释。此外，灌流模型建立复杂、成功率低，同样是限制其推广和发展的因素。尽管如此，灌流模型仍是现有技术能达到的、在最大程度上模拟生理情况且不违悖伦理的研究胎盘屏障的最好方法。进一步探索和建立简单、高效地反映胎盘屏障的灌流模型，仍然是未来研究的方向。参考文献1SchneiderHzPanige1.MzDancisJ.Transferacrosstheperfusedhumanp1.acentaofantipyrinezsodiumand1.eucineJ.AmJObstetGyneco1.z1972z114:822-828.2谢幸,苟文丽.妇产科学M.8版.北京:人民卫生出版社,2013:32-35.3 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