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2022美国临床实验室对临床质谱方法的质量管理要求(全文)摘要自从液相色谱串联质谱仪器问世以来，质谱技术在临床实验室中备受欢迎。由于绝大多数的临床质谱方法是未经美国食品药品监督管理局批准的实验室自建方法，为了确保检测结果的可靠性，对临床质谱方法进行质量管理,显得至关重要。美国临床和实验室标准化协会C62-A指南是一个基于对临床质谱方法的高标准质量管瑁旨导文件。本文以美国一个认证的临床质谱实验室为案例，阐述了其临床质谱方法设计开发、验证以及日常运营的质量管理要求。临床质谱方法质量管理的一致性和标准化不仅是实验室间质谱检测结果互认的必'要保证，也是难点和挑战。临床质谱是质谱技术在临床实验室中的应用，气相色谱和质谱仪联用的技术是最早应用在临床实验室中的。随着电喷雾离子化技术的发明1,商业化的液相色谱质谱联用仪应运而生。液质联用技术随后也在临床实验室,特别是在新生儿筛查、治疗药物监测、内分泌检测等领域得到较为广泛应用2,3,40虽然临床质谱的应用包括不同的质谱仪类型，但由于液相色谱和四极杆串联质谱仪的联用，已广泛、大量地应用于临床实验室的定量分析中，并逐渐被用来特指临床质谱，所以此类型几乎成为了临床质谱的代名词。目前为止，除了极少数临床质谱方法所用试剂是经美国食品和药物监督管理局(FOOdandDrugAdministration,FDA)批准的医疗器械类别，其他大部分的质谱方法都为实验室自建方法。此外，大多的临床质谱项目都集中在QuestDiagnostics和1.abCorp等美国大型第三方实验室。那么如何针对临床质谱实验室自建方法来进行有效的质量管理，本文就此做一个简单的介绍。一、实验室符合质量规范的要求目前，所有的临床质谱方法都归类为高复杂度方法。与其他的传统方法一样，一个以诊断为目标，提供临床质谱方法用于临床样本分析的实验室是需要认证的。此要求对于现有的临床实验室无碍，因为现有的临床实验室只需在已认证的实验室中加入质谱部分即可。然而对于一个从零开始建立的临床质谱实验室，就需要建立一套符合规范的要求。在美国，临床实验室是按照临床实验室改进修正条例(C1.inica1.1.aboratoryImprovementAmendmentsof1988)中规定的质量标准所建立的规范实验室。医疗保险和医疗补助中心(CenterforMedicareandMedicaidServiceszCMS)是联邦政府修正条例的执行机构。在具体执行的时候，CMS授予一些非营利机构,例如,美国病理学家学院(Co1.1.egeOfAmericanPatho1.ogists,CAP),来进行临床实验室认证资格评审。临床实验室按照CAP的清单来建设实验室就能达到符合质量规范的要求。CAP的清单包括一般实验室的要求。所有实验室共同的要求，以及各个不同专科的要求。临床质谱的要求包含在化学和毒理的清单部分。二、方法设计开发阶段的质量要求一个优秀的临床质谱方法源自卓越的设计和开发。在设计阶段，首先要收集以及明确需求。需求应该来自很多方面，很多维度，如临床医生（客户）的反馈；方法应用的对象人群对质谱方法的灵敏度和线性范围要求；临床应用的总允许误差要求对于质谱方法的准确度和精密度的要求；基于大型第三方实验室，还需更多地要考虑通量和成本的要求，通量可以保证以最快的速度得到检测结果,而较低的成本更可以给临床医生和患者带来益处。在开发的阶段，内标的选择对于一个优秀的质谱方法至关重要，稳定同位素内标是最佳选择。内标选择的优先次序依次是碳13（13C沐口氮15（15N）标记的内标品，然后是宗代（2H）的内标品，最后才是同系物和类似物。同样，标准品也需要选择高纯度的化学品以避免在今后实施阶段换批次时带来麻烦；在确定内标物和标准品之前，要用质谱方法对纯度进行检查，避免内标物和标准品之间相互干扰。在开发质谱方法的时候，在满足灵敏度的前提下，尽可能地增加子离子数目可以在即使遇到部分临床样本当中有干扰峰的情况下，也能通过选择不同的子离子来得到可靠的定量结果，尽可能地降低在临床应用阶段所遇到无法出报告的困难。液相色谱方法的开发原则是在满足目标分析物和其他干扰物基线分离的前提下尽可能地缩短分析时间来满足通量的需求。有的应用不需要液相色谱的分离，因为利用串联质谱的目标化合物子离子对的特异性就能达到很好的准确度和精密度要求；而有的应用，如目标分析物有同分异构体干扰的情况下，则需要利用液相色谱来进行同分异构体的分离，然后再用质谱来定量。前处理方法需要根据使用目的来选择，提高前处理程序的自动化程度有助于方法实施后的质量管理。对通量要求高的方法可以选择多个液相与质谱联用仪器或者超高效液相色谱仪器来解决。三、方法验证阶段的质量要求方法验证是指检验所开发的方法是否达到了设计输入的要求。CAP根据C1.IA88的要求，在所有实验室的共同要求清单中列出了对一个方法的验证项目。那么，如何对临床质谱方法进行验证来满足CAP的要求呢？一般来讲，大多数的临床实验室对实验室开发的方法验证是参考和使用美国临床和实验室标准化协会(C1.inica1.and1.aboratoryStandardsInstitute,C1.SI)的指南。C1.SIC62-A指南5是2014年出版的用于液质联用方法的指南。这个指南阐述了方法确认所需验证的内容，其中包括检测下限和定量下限、线性范围、稀释限度、准确度、精密度以及干扰研究。基质残留和基质效应的评估也在预验证的部分有较为详细的描述。虽然指南没有提到样本稳定性研究和参考区间的验证，但这两个部分也是在验证阶段必须要得到的结果。稳定性的实验并不是一个必需的验证内容，但加入这方面的研究会降低实施以后质量出现问题的风险和降低故障排除的频率。CAP清单化学和毒理的质谱部分(CHM.18825)明确要求在方法验证的时候需要评估基质效应。常见的基质效应评估方法：(1)使用目标分析物在空白基质抽提液中的响应值与流动相响应值的比值12胜后灌流60这2种方法也是C1.SIC62-A指南中推荐的方法。柱后灌流方法的好处是不仅可以半定量地评估目标分析物在保留时间处的离子抑制程度,而且还可以了解整个分析周期的抑制情况，这个信息在对实施阶段的故障排除，特别是分析物保留时间变化所引起的故障有非常好的指导意义。在评估了至少10个基质的基质效应后，如果离子的平均抑制或者增强超过25%,或者变异系数(coefficientofvariation,CV)超过15%的情况下,在验证阶段必须包括基质效应对方法准确度影响的研究。在得到了每一个验证项目的数据后，与验收标准来进行比较。如果有少部分的项目没有达到预设的要求，那就需要根据具体情况做平衡性的调整，例如监测下限的精密度在超出20%CV时,可以通过适当地降低灵敏度减少离子对的监测停留时间)来微调精密度，从而使检测下限的精密度以及灵敏度都能达到预设的要求。每一项验证内容的结果都要记录存档用于今后的CAP检查。CAP清单化学和毒理的质谱部分(CHM.18800)要求实验室对分析物的识别标准经过验证并且记录。在注释当中要求至少对分析物和内标用一个子离子检测，这个要求任何临床质谱的方法都可以满足，实验室主要是做好记录以提供检查的需要。四、方法实施阶段(日常运营)的质量管理要求临床质谱方法在经过了优秀的设计开发过程以及严格的验证程序后，就将进入日常运营阶段。而这个阶段其实是对临床质谱方法的真正检验阶段，即使一个非常优秀的临床质谱方法，在日常运营阶段都难免会碰到干扰峰的问题，这几乎是无法在设计阶段攻克的挑战，因为临床样本的基质是无法控制的，患者的饮食和药物都是可能引起干扰的因素。因此对于日常运营阶段最好的质量管理方法就是预防及监测。日常营运部分的质量保证和质量控制在C1.S1.指南C62-A中有较为清楚的介绍，大致可以分为对仪器的质量控制和方法的质量控制两部分。(-)对于仪器的监测1 .液质系统的适用性评估：在每次样品分析前，先用系统适用性样本，例如浓度最低的标准品，或一些已知的样品进行分析，然后运用已经建立起来的液质仪参数来评估仪器的表现是否适合检测临床样本。2 .液质系统的残留：用双空白和单空白的样本来监测仪器系统是否有干扰物、进样残留，或者其他可对定量造成影响的因素。3 .质谱的质量校正和调节根据仪器厂商的建议,对液质仪做预防性维护，周期一般为半年一次，具体频率可以根据仪器的使用频次情况决定。另外,CAP的清单部分(CHM.18600)要求实验室对质谱仪调节的频率和接受标准有具体的规定。4 .多个液质系统的监测：检测量大的测试需要多台仪器的联合运行。仪器之间的比对需要至少每半年做一次，从而保证不同仪器结果的准确性。（二）对于方法的监测1 .标准曲线的监测：标准曲线的斜率，每一个标准品标准值的允许偏差，和回归线性（R2）都应该建立一个接受标准，只有满足要求的标准曲线才能用于样本分析。在实际运营中，通常针对可以省略的标准品数目也予以规定。例如，如果1个标准曲线有至少6个浓度的标准品，那么有一个标准品通常可以被忽略，不纳入标准曲线斜率的计算，这样就不会因为一个标准品的离群值而影响整个批次的分析结果。2 .质控品的监测：与其他临床检验项目一样，临床质谱项目也需要使用质控品。由于基质效应对于质谱方法较为独特，所以质控品基质的选择更为重要。一般要求是选择与临床样本相一致的基质。虽然混合患者样本可以满足基质的要求，但要达到方法特定的浓度往往存在难度，并且从制备的角度来看，相对繁琐的程序会对实验室运营工作产生不小的负担。另外,质控品的稳定性一定要经过测试，以保证在使用期内的稳定性。质控品浓度的选择需考虑到应用人群和对象,如果在临床上有几个医学决定水平，那么在质控品浓度设计时，需考虑同时检测质控品的浓度在这几个医学决定水平的周围以保证方法的性能。质控品使用的频率通常根据方法的性能来决定，最佳实践的建议是分析的质控品数量至少是整个批次样品量的5%o此外，对于每个大于50个样品的批次，一个常用的实践是将质控品安排在批次的开始、中间和最后的位置。对于多通路液质仪和多分析物的质量控制，C-62A指南也提出了最佳实践的建议。多通路液质仪如何达到高通量？指南建议针对每个液相通路都分别设置一套质控品，但每个液相可以通过分析整套标准品的部分来建立标准曲线；对于检测多分析物的方法，特别是在药物检测中同时检测母体药物和其代谢物的应用方法，建议在母体药物的质控失控的情况下，将其代谢物的质控也视作失控，反之亦然。3 .内标回收率的监测：内标回收率的监测非常重要，因为这个指标不仅可以监测到方法的过程变动，例如内标加入时的错误，而且还能够监测到离子抑制的程度，严重的离子抑制程度会对检测结果的准确性带来影响70CAP清单化学和毒理的质谱部分(CHM.18850)要求实验室必须在常规测试的过程中，评估在患者样品中可能遇到的离子抑制或者离子增强的情况。Hayden和BaChmann8对用1.C-MS/MS方法检测25-羟维生素D的50个临床实验室做了一份质谱方法管理的抽样调查。在这50个实验室中，有94%的实验室在监测内标的回收率。然而，实验室对于回收率可接受的标准是不一样的。其中36%的实验室是用每一个样品的内标峰面积和在做验证时候的内标峰面积来进行匕戢;另外58%的实验室是用每一个样品的内标峰面积和其同一批的样品、质控品、标准品的平均值来进行比较。同时，每个实验室对于每个样品内标回收率接受的标准也是不一样的。大多数实验室用一个固定值，接受范围10%200%;另外一些实验室用一个定好的参考值加上标准差来建立接受范围。总之，在应用内标回收率这个参数来做质量控制的时候，实验室间存在很大的差别。对这个参数控制太严，有些时候就把对定量没有影响的检测结果也取消了；当然如果对这个参数控制太松，就可能发布错误的结果，从而影响患者的诊断和治疗。4 .离子对比值的监测：离子对比值是指目标分析物定性子离子和定量子离子的比值。对离子对比值的监测是保证目标化合物特异性的指标，是一个串联质谱仪所带来的特异性优势。对离子对比值的监测可以确定在任何临床样本中是否有干扰物的存在。C-62A指南提到建立离子对比值应该接受的范围，但没有提到具体的接受范围。一个可能的原因是不同的质谱方法可能有不同的样品前处理方法，例如用25%的固定值，应用到不同的检测方法可能会导致有些前处理方法简单的质谱方法，过多地出现在离子对比值范围外的样品。在目标分析物浓度低的情况下，因为定性离子非常接近检测极限所引起较大峰面积的变动也可以造成不能接受的离子对比值。在Hayden等8对检测25-羟维生素D的50个临床实验室的调查中，有26%的实验室没有监测离子对比值，但在这部分实验室中，有不少的实验室使用了某些衍生化的方法从而没有办法监测第二个子离子。在使用离子对比值的实验室中，对离子对比值的确定和接受范围都存在较大的差别。32%的实验室离子对比值的目标值是在验证阶段确定的，然而34%的实验室的目标值是实时确定的（用每批检测样品通过标准品、质控品、患者样品的离子对比值的其中一个或者不同的组合来确定）。离子对比值的接受范围也有较大的差异。严格的实验室用10%,而最高的实验室把范围放宽到40%。在毒理学分析中，发布检测结果必须满足离子对比值的要求，所以在接受范围之外的临床样本就不能发布报告。当这种情况发生时，折中的方法就是给出定量的结果，同时也提供相关的分析信息，从而让临床医生可以结合临床表现和其他因素来做出诊疗判断。5 .保留时间的监测：离子对是质谱特异性的指标，而保留时间则是液相特异性的指标，使用这个指标可以有效地排除干扰物。分析物相对于内标的相对保留时间的接受标准应该在验证的阶段就建立起来，在接受标准以外的色谱峰很可能是样本中与目标分析物色谱行为非常相似的干扰物所产生的。6 .试剂更换可接受性的监测：试剂更换是所有临床检测方法的f常规程序，对于质谱方法也不例外。色谱柱和流动相是色谱分离的重要试剂，必须要经过验证才能用于临床样本分析。同样，标准品的批次更换也很重要,因为标准品的批次更换会引进系统偏差。尤其对于实验室开发的方法，一般临床实验室并不具备良好生产规范(goodmanufacturingpractice,GMP)的条件和经验，所以实验室必须建立标准品更换批次的接受标准,从而把标准品批次更换引进的系统偏差最小化。7 .能力验证：能力验证最常见的一个方法是参加外部质量评估计划。如果实验室开发的目标分析物是CAP能力测试目录中已经包括的分析物,那就必须注册参加CAP的能力验证活动。如果分析物是CAP没有的项目，那就可以选择替代绩效评估(a1.ternativeperformanceassessment,APA)来进行能力测试。实验室应该对APA的方法、频率和接受标准予以规定。8 .准确度和溯源性的评估：在条件允许的情况下，实验室可以定期分析一下可得到的参考物质或者一些由参考测量方法赋值的样本，这样就可以定期监测方法的准确度和溯源性。五、小结C1.SIC62-A指南是针对临床质谱方法质量管理的高标准的实践指导文件。然而，目前的临床质谱方法所遵行的标准是CAP的质量管理要求。两者之间的质量要求是存在差距的。25-羟维生素D的检测现状反映了临床质谱的质量控制在不同实验室之间的区别。所以今后如何来达到临床质谱方法的质量管理的一致性和标准化是一个挑战。是增加CAP的清单内容来提高质量管理要求的细节呢？是通过C1.SI指南的更新来对一些质量指标和接受标准提供更容易实施的细节性的要求呢？还是通过FDA把实验室开发的测试方法纳入监管范围，把每一个临床质谱的方法都看作是医疗器械来进行统一的质量管理呢？无论今后的发展是朝着哪一个方向，有一些基础性的工作可以为今后临床质谱质量管理的标准化作铺垫和贡献。例如，先将标准品、质控品以及液质仪进行标准化管理，在此基础上再进一步统一质量控制指标和接受范围，从而达到检测方法的统一，以及质量控制指标和接受范围的统一。这样，临床质谱方法就能更好地为临床医师提供更准确的检测结果，从而在疾病预防、诊断以及疗效监测等方面更好地为患者服务。