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2023凝血标志物在危重症儿童血栓性疾病诊断中的应用(全文)摘要儿童血栓性疾病的发病率远低于成人，但近年来在危重症儿童中血栓性疾病的发生率明显增高。儿童常见的血栓性疾病包括：静脉血栓疾病、动脉血栓疾病、血栓性微血管病。各类血栓性疾病临床表现和实验室检查有较大差异，但均涉及促凝血和抗凝血之间、纤溶和纤溶抑制之间的失衡。传统凝血标志物和近期发现的凝血分子标志物能客观反映机体促凝机制的激活、抗凝的启动、以及纤溶活动的强弱。充分、合理认识儿童各种凝血标志物的变化，有助于早期发现和诊断血栓性疾病。儿童血栓性疾病的发生率远低于成人，但近年来随着血管内置管技术的应用、体位制动、手术、化疗等原因，机体处于凝血活化状态，儿童血栓性疾病的发生率逐渐升高。据美国2007年的一项研究估计，每1万住院患儿中，发生静脉血栓(VenOUSthromboembo1.ism,VTE)58人次；而PICUVTE患病率可达0.74%20一项回顾性研究发现，2001至2014年美国儿童肺动脉栓塞的发生率较以往升高1倍3。儿童血栓性疾病分类包括VTE、动脉血栓疾病(arteria1.thrombosis).血栓性微血管病(thromboticmicroangiopathy,TMA)以深静脉血栓(deepvenousthrombosis,DVT)和月市动脉栓塞(PIJ1.mOnaryembOIiSm,PE)最为多见。儿童动脉血栓可分为导管相关和非导管相关，前者主要诱因是各种动脉内置管(如新生儿脐静脉插管、心脏置管、有创动脉置管监测血压等);非导管相关动脉血栓多见于先天代谢紊乱(如先天性代谢异常)、川崎病、大动脉炎、特定脏器动脉闭塞等4。儿童TMA主要包括血栓性血小板减少性紫藏(thromboticthrombocytopenicpurpura,TTP)、溶血尿毒综合征(hemo1.yticuremicsyndrome,HUS)、干细胞移植相关血栓性微血管病hematopoieticstemce1.1.transp1.antation(HSCT)-associatedthromboticmicroangiopathy,TA-TMA5儿童血栓性疾病主要涉及遗传性和获得性两种机制，以后者居多。遗传因素主要是先天凝血功能异常,如先天性蛋白S(proteinS,PS)缺乏症、先天性蛋白C(proteinCzPe)缺乏症、先天性抗凝血酶(antithrOmbin,AT)缺乏症、凝血因子V突变(FV1.eiden突变)和凝血酶多态性异常(20210突变)等。获得性因素包括血管内置管、先天性心脏病、严重感染、恶性肿瘤、自身免疫、危重状态等。此外，随着体外膜肺氧合(extracorporea1.membraneoxygenation,ECMO)的使用，其导致的血栓事件值得关注,包括ECMO诱导的静脉血栓(ECMO-associatedVTE)和氧合膜血栓(OXygenatorthromboSiS)事件，前者发生率约18%85%,后者发生率约10%16%.在血栓形成的发生发展过程中，存在凝血-抗凝和(或)纤溶-抗纤溶间的失衡，理解凝血、纤溶标志物作为凝血和纤溶活动的证据，有助于血栓性疾病的早期诊断。1儿童止血发育的特点熟悉儿童止血发育的动态平衡(deve1.opmenta1.homeostasis)对解读儿童凝血标志物非常必要。儿童时期凝血系统发育相对不成熟，和成人比较,大多数血浆促凝和抗凝物质在凝血平衡的前提下，处于较低水平6。婴儿血浆Fn和FX浓度约为成人水平的35%,矫正年龄6个月时约为成人水平的80%;足月新生儿维生素K依赖凝血因子(FU、FVH、FIX、FX)和接触因子(FX1.FXxPK、HM-WK)在出生时仅为成人的50%,6个月时为成人的80%;在116岁的健康儿童中，虽然其凝血系统已趋于成熟,但凝血因子(HV、皿、IX、X、XI、Xn)平均值低于成人10%20%7-8o凝血酶原时间(PrOthrOmbintime,PT)和国际标准化比率(internationa1.norma1.ized,INR)在新生儿时期延长,以后与成人值相似;出生后6个月内活化部分凝血活酶时间(activatedpartia1.thrombop1.astintimezAPTT)延长;1岁以前所有凝血系统的抑制物(如AT、PS、PC)处于较低水平。因此，在解读儿童凝血标志物的临床意义时，应考虑到其止血发育特点导致的指标变化。2危重患儿发生血栓性疾病的机制2.1 凝血系统过度激活在病理状态下,主要通过组织因子(tissuefactor,TF)激活外源性凝血途径，单核巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和血小板等均能在其刺激因子(包括微生物及其代谢产物、细胞因子、趋化因子、补体、急性反应时相蛋白、生长因子等)作用下直接释放TF。止匕外，TF能将正常状态下与凝血无关的细胞膜转化成有促凝功能的细胞膜。细胞之间的相互作用也可促进TF的合成与释放，例如内皮细胞、单核细胞、T细胞、自然杀伤细胞、活化的血小板等9。近年来研究发现，细胞外DNA(CeII-freeDNA,CfDNA)和DNA结合蛋白能激活内源性凝血系统，中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、肿瘤细胞和一些特定的细菌均可释放cfDNA。病理状态下，由于细胞坏死物增加和机体清除能力下降，血液中的CfDNA水平会显著升高通过激活FX1.I和FX1.进而启动内源性凝血途径10-12。2.2 抗凝系统受损正常情况下，机体凝血和抗凝功能处于动态平衡，保证机体处于轻度的抗凝状态。抗凝系统主要通过3条途径拮抗凝血激活：AT途径、活化蛋白C(activatedproteinC,APe)途径和组织因子途径抑制剂(tissuefactorpathwayinhibitor,TFP1.)途径。在某些病理状态下,机体的天然抗凝物质功能受损，表现为：(1)先天性抗凝物质减少或缺乏：如先天性AT、PC、PS缺乏症等；(2)抗凝功能继发性受损：由于各种原因导致的血管内皮细胞受损，进而造成AT、血栓调节素(thrombomodu1.in,TM).血管内皮细胞蛋白C受体(endothe1.ia1.proteinCreceptorzEPCR)、PS、TFP1.等一系列抗凝物质的减少，如高同型半胱氨酸血症、抗磷脂抗体阳性继发的抗凝物质受损等。2.3 纤溶功能低下纤溶异常在危重患儿中常见于先天遗传性疾病，如异常纤溶酶原血症、纤溶酶原激活物抑制剂过多症、异常纤维蛋白原血症等造成纤溶功能低下等,往往导致遗传性易栓症口3o获得性血浆纤溶活性异常多见于血液肿瘤、严重肝病等，这类患儿常有纤溶功能降低和抗纤溶活性增高，形成血栓倾向。3诊断血栓性疾病的生物标志物3.1 凝血因子活性检测是最常用的诊断特定凝血因子缺乏的方法。常见的凝血因子缺乏包括遗传性和获得性因子抑制剂。前者常见血友病A(FVI1.I)、血友病B(FIX)、血友病C(FXI)和其他罕见凝血因子缺乏；后者常见于凝血时间异常且存在混合血浆纠正试验无法被纠正的状况。PT主要反映外源性凝血通路状况，缩短见于血液高凝状态和血栓性疾病等；APTT反映内源性凝血通路情况，缩短见于高凝状态，如促凝物质进入血液及凝血因子的活性增高。APTT易受到肝素的影响，应注意避免标本中混有肝素。PT和APTT在婴儿期较成人有较大差别，判断异常值时需结合早产和年龄情况分析。一般来说，较同龄正常值差异1.2倍以上才有意义。3.2 抗凝物质检测怀疑遗传性血栓性疾病患儿，可筛查抗凝血标志物水平14-15。3.2.1 AT活性检测AT是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员,主要灭活血浆凝血酶、FXa和FIXa。肝素可显著增强AT的抗凝活性(约1OoO倍)。先天性AT缺乏症在VTE人群中约占1%2%。患者通常是杂合突变携带者，在青春期或成年早期可出现静脉血栓表现,家族遗传特性明显。获得性AT缺乏比较常见，如肝素治疗导致AT消耗增加、DIC或其他消耗性凝血病、肝病、肾病综合征等。如AT活性降低至正常水平50%以下，需要警惕AT缺乏引起的血栓风险16。3.2.2 PC活性检测PC是维生素K依赖性抗凝物质，APC灭活FVa和FWa从而发挥抗凝作用。与此同时，APC还可通过灭活纤溶酶原激活物抑制剂(PIaSminOgenactivatorinhibitortype1,PAI-1)来增强纤维蛋白溶解。先天性PC缺乏症在VTE人群中约占3%5%,纯合子突变通常不能存活或在新生儿期发病，以暴发性紫藏为典型表现；杂合缺陷存在形成血栓的风险，OR值较正常人群高510倍，以静脉血栓栓塞为主，当PC活性降低至正常水平60%以下,提示存在发生血栓的风险,新生儿期的暴发性紫痛可降低至正常水平的10%以下17o获得性PC缺乏常见于维生素K缺乏症、香豆素化合物口服抗凝治疗、肝病、DIC等。3.2.3 PS活性检测PS亦是维生素K依赖的血浆抗凝糖蛋白，主要在肝脏中合成。PS是APC的必需辅助因子，促进活化FVa和FVIDa的蛋白水解。大约60%的PS抗原与血浆C4b结合蛋白(C4b-BP)结合,剩余则为“游离”PS。只有游离PS具有抗凝活性，当游离PS比例下降至20%以下，需警惕血栓倾向。先天性PS缺乏症是常染色体显性遗传性疾病，占静脉血栓栓塞患者的3%5%。PS杂合突变携带者的静脉栓塞发生风险比正常人增加约510倍，也易发生动脉血栓。PS纯合突变较为罕见，临床上可表现为新生儿暴发性紫瘢。3.3 反映凝血激活的标志物3.3.1 血小板计数血小板减少反映持续的凝血激活、微血管损伤和器官衰竭。血小板持续降低是血栓性疾病非常重要的诊断依据，无血小板持续减少不考虑诊断血栓性微血管病18。3.3.2 凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombincomp1.ex,TAT)是凝血系统激活分子标志物。凝血酶是凝血的关键因子，由凝血酶原激活物在钙离子参与下激活凝血酶原而生成，生理情况下体内仅有少量酶生成,之后很快与AT结合生成TAT而灭活。凝血酶含量极低且不稳定，很难直接测定。通过检测血液中TAT可间接评估凝血酶水平,TAT水平升高能反映凝血酶生成量和活性，提示凝血系统激活，能早期反映凝血功能异常，有发生血栓的风险19。3.3.3 TM是血管内皮系统损伤标志，血浆TM水平可反映内皮细胞损伤的程度，且与损伤程度呈正相关。TM与凝血酶结合形成血栓调节素-凝血酶复合物,从而抑制凝血酶介导的纤维蛋白原凝固以及血小板的聚集和FVxFVIxFIX、FVIn的激活，发挥抗凝血作用。此外它能增强抗凝血酶的活性；TM与凝血酶结合增强凝血酶活化PC的作用；TM能直接抑制凝血酶活性，同时能促AT灭活凝血酶；TM可以激活纤维蛋白溶解抑制剂，促进纤溶。TM作为内皮细胞分泌的一种抗凝标志物，当内皮细胞受损时其分泌释放增加，在抗凝、促进纤溶等方面对机体起着保护作用20。3.4 反映纤溶状态的标志物3.4.1 纤维蛋白降解产物(fibrindegradationproducts,FDP)FDP是纤溶系统活性的筛选指标之一，升高提示纤溶活动亢进。多见于创伤、炎症、近期手术、VTE,常和D-二聚体(D-dime联合检测，判断凝血和纤溶失衡而导致的疾病。此外FDP由肝脏代谢经肾脏分泌，易受肝肾功能影响21。3.4.2 D-dimers是相邻的2个纤维蛋白单体D结构域组成,2个D-结构域之间由活化的FXI催化交联起来形成D-dimers,它反映纤溶的活跃程度，D-dimers结合FDP能一定程度鉴别原发性与继发性纤溶亢进。D-dimers增高见于继发性高凝状态、DIC、肾脏疾病、器官移植排斥反应、溶栓治疗等。D-dimers的检测方法较多,不同检测方法的阳性参考值有较大差异，一般认为其临界值为500ng/m1.,当低于临界值时，对部分临床症状较轻的患者,排除血栓性疾病的特异性可超过99%22oD-dimers升高表明纤溶活跃，应警惕血栓形成，进一步相关检查。3.4.3 凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombinactivatab1.efibrino1.ysisinhibitor,TAFI)组织型纤溶酶原激活剂(tissuep1.asminogenactivator,t-PA)在血凝块表面激活纤溶酶原(P1.aSminOgen,PA)为纤溶酶从而启动纤溶。纤溶酶部分降解纤维蛋白使其C端赖氨酸残基暴露于纤维蛋白表面。这些赖氨酸残基进一步激活纤溶酶，纤溶酶从而大量生成。TAFIa可将部分降解的C端赖氨酸残基移除，使其丧失进一步激活PA的作用,从而使t-PA的纤溶作用明显降低。只要TAF1.达到一定的临界浓度，纤溶将被抑制处于初始阶段。持续高于临界值的低水平TAF1.激活远比短时间高水平的TAFI激活有效;TAF1.大量生成,会抑制纤溶活性,阻碍纤维蛋白溶解,促进血栓形成23。3.4.4 组织型纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制剂复合物(tissue-typep1.asminogenactivatorandp1.asminogenactivatorinhibitortype1comp1.ex,t-PAI.C)反映凝血纤溶系统激活变化，是血管内皮系统损伤和纤溶系统的分子标志物。由血管内皮细胞释放到血液的t-PA与生理性抑制因子PAI-1迅速以11结合,形成t-PA1.Co血浆中PAM调节失衡，t-PA1.C生成过多，可能会引起纤维蛋白沉积，从而促进血栓形成。t-PA1.C复合物增加意味着血液中t-PA浓度增加，即可认为是纤溶系统的分子标志物，也可以认为是血管内皮细胞受损的分子标志物，也是VTE最佳诊断指标之一24。3.5 临床意义3.5.1 凝血标志物用于血栓性疾病的早期诊断反映促凝机制激活的标志物如TM可以反映内皮细胞的损伤程度，能早期反映凝血激活状态，与血栓性疾病的进程同步变化，起到较好的警示作用。TAT是凝血激活的最早产物，能早期提示高凝状态。Chen等25研究心导管手术患儿使用肝素对凝血激活后凝血酶生成的影响，发现未使用肝素的患儿在心导管手术开始后15minzTAT就开始明显上升,手术结束时升高超过5倍，而使用肝素预防血栓的患儿，TAT没有明显升高；另外未使用肝素的患儿TAT较D-dimers升高更加明显,作者认为TAT能更早期反映凝血激活。1.ee等26报道在133例骨盆和下肢骨折手术的患者中,按常规给予DVT预防治疗，术后第1、3、7天检测TAT和D-dimers,发现在最终发生VTE的患者中，术后第3、7天TAT和D-dimers明显升高，可作为有效的术后VTE筛查指标，其阴性预测值和D-dimers相当。Kitayama等27认为在血栓性疾病中均有血栓形成的病理过程，凝血酶参与的凝血级联反应过度激活是血栓形成因素之一，检测TAT可早期预测血栓的形成，对DVT、PE、心房颤动相关的血栓性疾病起到预警作用。但Jo1.y等28随访134名静脉血栓高危孕妇，定期监测TAT.TM和其他分子标志物，结果未发现能很好提示VTE的指标。需要指出的是，在VTE形成的急性期可因抗凝物质消耗，出现抗凝物质水平的短暂下降，故不推荐在VTE急性期进行抗凝物质活性水平的检测。肝素抗凝治疗可能会干扰AT活性的检测结果,建议停用肝素24h以上进行检测。华法林抗凝治疗常伴有PC和PS活性水平的下降，PC和PS活性的检测应在完成口服抗凝治疗，停用华法林至少2周以后进行。因此，一般不应仅凭一次实验室检测的结果确诊先天性抗凝物质缺乏症。3.5.2 反映纤溶活动的标志物如D-dimers.TAFI和PAI-1在静脉和动脉栓塞疾病的早期诊断显示出特有的价值。D-dimers是广泛用于临床血栓性疾病诊断、疗效评估、预后判断的指标。严重感染、恶性肿瘤、创伤、高龄等均可使D-dimers升高1,29。其诊断静脉栓塞性疾病的灵敏度高达92%100%,但其特异度低(40%43%),具有较高的阴性预测价值，即D-dimers阴性基本可以排除静脉和动脉血栓性疾病。近年研究还发现，D-dimers是复发性DVT的风险预测因子30,其水平持续较高的患者，再次发生静脉血栓的风险明显增加。Gokce等31调查了23名有复发性静脉血栓发生的儿童，发现86.9%患儿D-dimers大于正常值。此外，反映纤溶功能低下或过度抑制的标志物(如TAFI和PA1.-I)水平的升高与静脉或动脉血栓疾病有关，如Song等29综合分析了现有众多相关文献的6万例冠心病患者和12万对照者的临床资料后认为：PAI-1与冠心病之间有因果关系；deBrUijne等32研究了327例冠心病或脑血管病的年轻患者，并以同比例健康年轻人为对照，结果发现TAFIa较对照组明显升高，TAFI具有325Thr/I1.e多态基因型的患者，血浆TAFI水平降低，发生动脉栓塞的风险较低，这种情况尤其在冠心病亚组患者更加显著。Eichinger等33研究了600例首次发生VTE患者，血浆TAFI水平在第75百分位以上者，2年内再次发生VTE的风险系数是其他患者2倍以上。Me1.tzer等34研究了743例VTE患者高水平TAFI和PAI-1提示VTE的高风险还有研究发现高水平TAFI和缺血性脑中风以及抗磷脂抗体并发血栓有显著相关35-36。但是，有一些研究结果认为TAFI不能有效地反映血栓事件的发生。Fo1.keringa等37调查了具有静脉或动脉血栓高风险家庭成员1940人,发现其中187人的血浆TAFI升高，这些人的VTE发生率为0.23%,而TAFI正常人群中的发生率为0.26%;高TAFI人群中的动脉栓塞发生率为0.31%,正常人群中的发生率为0.23%,因此作者认为TAFI升高不能作为发生血栓的早期信号37。VanTi1.burg等38研究了474例发生过DVT患者的TAFI,并按年龄-性S1.J匹配同样人数的正常对照组，结果发现正常对照中TAFI水平在第90百分位以上者发生VTE风险升高近2倍，但整体来看，TAFI水平升高只能提示发生VTE风险的轻度增加。3.5.3 血栓性微血管病的诊断主要根据血小板减少、贫血、相应脏器功能损害情况综合判断，在TTPxHUSxTA-TMA等疾病中，传统的凝血指标如PTxAPTTxFIBsD-dimers以及凝血分子标志物TAT、TM、TAFI、PA1.等大多无显著变化，没有明确的诊断价值18。4小结危重症儿童是血栓性疾病的高危患儿，需要警惕血栓的发生，在儿童常见的3类血栓性病变中,血栓的确诊主要靠影像学（MRI、CT）和超声，传统的凝血标志物D-dimers是目前应用最为广泛的指标,有较好的敏感性和阴性预测价值，但特异性并不理想。近年来新发现的各类凝血功能分子标志物，能早期敏感地反映凝血和纤溶的激活和抑制情况。