论文开题报告.pptx
姓 名,导 师,成人隐匿性自身免疫性糖尿病多因子联合检测与临床应用,目录,1,2,3,4,选题背景及意义,研究内容加方法,实验创新及难度,进度和完成情况,选题背景及意义,1,LADA简介：糖尿病已经成为继恶性肿瘤和心脑血管疾病的第三大健康威胁。我国已成为糖尿病第一大国，患者数近1亿。绝大多数糖尿病患者分为1型（TIDM）2型糖尿病(TIDM)，TIDM主要是指因自身免疫性因素导致胰岛细胞破坏以及胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病；T2DM则是以胰岛素抵抗为主，伴有细胞进行性衰竭和胰岛素分泌进行性下降。近年来研究发现，在初诊为T2DM的患者中，有部分患者在半年到几年内发展为依赖胰岛素治疗的TIDM。1998年WHO提出将这类患者命名为成人晚发型自身免疫性糖尿病（Latent autoimmune diabetes in adults）,即LADA。,2,LADA特征LADA是一种成人发病的1型糖尿病，而不是一种独立病种，也不是1型和2型之间的过度状态。它与儿童发病的TIDM相比，起病晚，隐匿，发展相对缓慢，早期不依赖胰岛素，饮食、运动控制和口服降糖药有效，貌似T2DM临床表现，临床上常当作T2DM来治疗。但经数年后本病大量胰岛素衰竭，需要依赖大剂量胰岛素，且极易发生多种并发症，病情不易控制，此特征与TIDM类似。近年来研究还发现，该病早期即给予胰岛素治疗可以保护残存胰岛细胞功能，延缓病情进展和并发症的发生。因此，早期诊断、早期治疗、延缓胰岛细胞功能进展是临床上亟待解决的课题。,LADA的诊断目前国内外比较公认的诊断标准，国际糖尿病免疫学会（IDS）对LADA的诊断建议基于3条标准：（1）成年人起病；（2）诊断糖尿病后至少半年不依赖胰岛素治疗；（3）胰岛自身抗体阳性。所以，胰岛自身抗体是目前筛查和诊断LADA的主要免疫学手段。常见的胰岛自身抗体包括：GADA(谷氨酸脱羧酶抗体)IA-2A（蛋白酪氨酸磷酸酶2自身抗体）IAA（胰岛素自身抗体）ZnT8A（锌转运体-8自身抗体）ICA(胰岛细胞抗体)：CHPA（羧基肽酶H）：,这几种抗体在初诊T2DM患者中阳性率、阳性重叠率以及对患者胰岛功能的影响各不相同，仅仅靠其中一种检测易引起LADA的漏诊。为提高LADA阳性筛查效率，做到早诊断早治疗，并更准确地检测胰岛功能，联合抗体检测可提高LADA诊断的敏感性。本研究就是把现在热门的液体芯片技术跟这四种抗体联合检测相结合，灵敏、准确、快速地一次性检测四种抗体，从而大大提高LADA的临床诊断水平以及更好的监测疗效。,2023/5/8,4,液体芯片美国Luminex 公司开发出的液态芯片技术平台是一种全新概念的生物芯片。该技术的核心是把微小的乳胶颗粒（5.6um）用荧光染色的方法进行编码，每种颜色的微粒（或称为荧光编码微粒）代表一种检测标志物。应用时，把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后再加入微量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性地结合。最后用激光流式仪判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以一个微量液态反应体系中同时检测100个指标。Luminex公司称之为“xMap”技术，这个词用中文很难翻译。又因含微粒的溶液肉眼观是澄清透明的，所以又有liquidchip,液态芯片之称。该仪器在我国SFDA进口注册时被称为“多功能流式点阵仪”。,液体芯片原理,液体芯片优点在于：1高通量：仅需微量样本(10m)，最多 100个指标。2高速度：最快可达 10 000测试h。3低成本：试剂用量少，能有效降低临床应用的试剂成本。4灵敏度高：检测低限可达 pgml。5重复性好：每个指标有 5 000个反应单元，分析 100 次取平均值。6线性范围广：检测范围达 6个数量级。7操作简便：无需洗涤：减少误差来源。液体芯片作为最新一代的多指标并行检测技术平台，具 有检测速度快、结果准确性高、操作简便、功能强大、成本低 廉等诸多优点，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分 析、受体和配体识别分析等研究，在临床诊断、生物医学(包 括基因组学、蛋白质组学)研究等领域都有着广泛的应用，代 表着生命科学基础研究和医学诊断技术的发展方向。,本课题研究的目的：应用液体芯片技术，联合定量测定糖尿病患者血清GADA、IAA、ICA，IA-2A，ZnT8A,CHPA并对其临床应用进行评价。意义及应用价值：本研究采用液体芯片技术，通过实验建立糖尿病患者血清GADA+IAA+ICA+IA-2A+ZnT8A+CHPA的联合检测系统，可在2-3小时内联合测定1-2l血清中的多抗体水平，该方法操作简单、快速、灵敏度高、重复性好、检测范围广，克服传统免疫学方法一次只能检测一个指标的缺点，有望成为LADA早期诊断、干预治疗及疗效评价的有力手段。,国内外研究现状及发展趋势：张曼华、张丽等探讨GADA、ICA、IAA在LADA中的表达和临床意义中指出联合检测GADA、ICA可从T2DM病人中及早发现LADA。周智广、潘玲玲等对四种自身抗体联合筛查成人隐匿性自身免疫糖尿病的策略研究中指出联合检测GADA、IA-2A、IAA、ZnT8A可提高LADA的阳性诊断率。以上研究中抗体检测法均为比较繁琐的传统免疫学方法，敏感性低，一次只能检测一项指标。锌离子转运蛋白8抗体（ZnT8A）、羟基肽酶H抗体（CPHA）是最新发现的两种胰岛素自身抗体，Wenzlau JM研究发现联合检测ZnT8A、GADA、IA-2A、IAA和ICA，可以将诊断的敏感性提高至98%。Yang L等研究指出联合检测GADA和CPHA对于诊断LADA的效率是最佳的。目前已有多篇利用液体芯片技术进行自身免疫研究的研究报道。其中一个试验同时检测了5种可提取性核自身抗原，与公认的单一试验ELISA法相比具有良好的相关性。另一个小组研究了37例干燥综合症患者血清中的抗核抗原(ANAS)和可提取性核抗原。他们分别在84和76的患者血清中检测到干燥综合症A抗原和B抗原(SSA和SSB)的抗体。目前国内外尚无用液体芯片进行LADA的诊断的相关报道，本研究拟建立LADA多抗体联合检测的液体芯片，包括ZnT8A、GADA、IA-2A、IAA、ICA和CPHA六种自身抗体的联合检测，并探讨其临床价值。,研究内容及方法、成果、创新,研究主要内容,（1）应用液体芯片技术开发GADA、IAA、ICA、IA-2A、ZnT8A、CHPA联合检测试剂盒；（2）将其结果与临床应用试剂盒（ELISA法）结果进行比对；（3）结果与临床糖尿病人资料进行比对，讨论评价其临床应用。,研究方法,1.文献研究法：搜集整理相关研究资料，为研究做准备；2.标本收集；3.应用液体芯片技术联合检测LADA患者血清中GADA、IAA、ICA、IA-2A、ZnT8A、CPHA的水平，制备交联微球以及生物素标记抗体利用双抗体夹心法对80个血清样本进行测定。并将其结果与酶联免疫法（ELISA）结果进行相关性分析，及各种抗体最佳组合的分析。,研究方法,微球编码：在其制作过程中按照严格的精确比例掺 人了两种不同的红色分类荧光染料，每种染料各有10种区分，因而根据其搭配比例不同可以把球型基质分为100种；共价交联：根据不同研究目 的而标定特定抗体、核酸探针与各种受体探针，以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，然后加入到一个液相检测体系中；结合反应：先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素结合 反应(本研究采用双抗体夹心)；激光检测：微球 形成单列通过两束激光，红光判定微球的荧光编码，确定多指标中的指标类型，绿光测定微球上报告分子的荧光强度，确定该指标的浓度，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定被结合的检测物的种类和数量，完成实时、定性和定量分析。,预期成果及创新,该研究预期成果是液体芯片联合检测法与酶联免疫法试剂盒检测结果有良好的相关性，并能从目前的六种抗体检测中找出最适合LADA诊断的最佳抗体组合，开发针对LADA的液体芯片试剂盒。本研究创新点在于将新型的检测技术与LADA的诊断相结合，具有检测范围更广、灵敏度更高、标本用量少，并可以重复测定等优点。,课题研究需解决的问题、方法,可能遇到的困难和问题：液体芯片自身免疫测定法的普遍认为存在一些技术障碍与核酸芯片相比，蛋白质芯片的开发难度更大这是因为蛋白质在分子大小、电荷、外形、疏水性、基因转译后形成的类型和程度、以及四级结构方面具有很大区别而且一些蛋白质连接在固相载体上后难以保持特异性和活性。如何将蛋白质分子稳定可靠地包被到微球上？与微球反应的蛋白质主要通过共价键连接，但是，即使彻底清洗后通常还会有一些疏松连接的蛋白质。与小球装置非共价连接的蛋白质会从固相表面缓慢解离，并抑制液相反应物的正常反应，结果就可能出现假阴性。解离的蛋白质也可能迁移并依附到另一小球装置的表面，导致假阳性结果。,解决问题初步设想：应进行全面的稳定性试验，以确保结合了配合基的蛋白质在产品保存期内都可与固相基质稳定结合在分析验证阶段，必须确保多路复用分析的结果与相应的单路分析结果相当。稳定性试验最好在标称的保存期末进行，这时最容易发现同题。只有所有分析物的多路和单路分析结果都近乎相同时。研究人员才能认定小球装置的混合并未产生相互干扰多路复用测定中潜在的相互作用数是微球芯片中测定次数的一个函数。随着芯片复杂程度的增加，各分析之间可能发生的不良作用也快速增加。生产前必须解决这一干扰问题,选题可行性及保障条件基础分析,可行性分析：（1）本医院是大型综合性医院，标本来源庞大，病人资源丰富。（2）液体芯片技术开发技术已经成熟，已经有相关自身抗体的报道。（3）ELISA法已经有针对LADA自身抗体检测的成熟试剂盒。本课题经费：泰州市人民医院高层次人才科研启动经费100万。工作条件和基础：（1）本科室是省重点科室，具有科研资质。（2）有优良的研究团队。（3）设备：泰州市医药城相关开放检测平台，并与本院有良好的合作关系。（4）标本来源：泰州市人民医院内分泌科病例，及与省内三甲医院内分泌科有良好合作关系。标本来源：泰州市人民医院内分泌科病例，及与省内三甲医院内分泌科有良好合作关系。,进度安排及完成情况,请输入您要的容请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容,2016.9-2016.12 文献资料的收集、阅读、调研2016.8-2016.11 论文开题2017.1 讨论分析2016.9-2017.5 调查采样试验2017.6-2017.8 资料或数据结果处理与分析2017.8-2017.10 论文撰写以及修改2017.10-2017.11 论文评审2017.12 论文答辩,谢谢您的聆听,
