苯胺-4-羟化酶AH活性测定试剂盒说明书.docx
苯胺4羟化酶（AH）活性测定试剂盒说明书微法100管/48样注意，正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：细胞色素P450癖是一组主要存在于肝脏的同工布，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。潴定原理：AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚引噪复合物，在63Onm处有特征吸收峰；通过测定63Onm吸光度增加速率，来计算AH活性。自务仪器及用品：普通离心机、超速离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、双蒸水和冰。试剂组成和配制：试剂一：粉剂Xl瓶,试剂二：液体Xl瓶, 试剂三：粉剂Xl瓶, 试剂四：粉剂Xl瓶, 试剂五：液体Xl瓶,4C保存。4C保存,4七保存。4C保存。4C保存。临用前加入IOomL蒸储水，充分溶解。临用前加入IOmL蒸憎水，充分溶解。临用前加入5mL蒸储水，充分溶解。试剂六：粉剂Xl瓶（腐蚀性试剂），4避光保存。临用前加入IOmL蒸储!水，充分溶解.试剂七：粉剂Xl瓶，4C保存。临用前加入IOmL蒸镯水充分溶解。标准液：液体Xl瓶，IOumolZL,4避光保存。粗胸液提取：1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入ImL试剂一，冰上充分研磨，10000g4°C,离心30min,取上清液，转移到超速离心管中。2、粗制微粒体：IOOoOog4,离心60min,弃上清液。3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加ImL试剂一，盖紧后充分宸荡溶解，IOOooOg离心30min,弃上清液。4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,盖紧后充分震荡溶解，即粗陋液，待测。渊定操作：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到630nm,蒸储水调零。2 .试剂三置于37水浴中预热30min.3 .试剂五置于冰浴预冷30min,4 .标准管：取0.5mLEP管，加入IOOL标准液，100L试剂六，100L试剂七，混匀后室温静置30min,吸取200L于微量玻璃比色皿/96孔板，630nm测定光吸收，记为A标准管。5 .对照管，取0.5mLEP管,加入50L粗酶液，100L试剂三,50L蒸镭水,混匀后37C水浴中保温30min；再加入100L试剂五，混匀后冰浴5min,IIOOOrpm,4C,离心Iomin；取100L上清液，加入新的0.5mLEP管；再加入IOOL试剂六，100L试剂七，混匀后室温静置30min,吸取200L于微量玻璃比色皿/96孔板，63Onm测定光吸收,记为A对照管。6 .测定管:取0.5mLEP管,加入50L粗酶液，100L试剂三,50L试剂四，混匀后37C水浴中保温30min；再加入100L试剂五，混匀后冰浴5min,IIOOOrpm,4C,离心Iomin；取100L上清液，加入新的0.5mLEP管；再加入IOOL试剂六，100L试剂七，混匀后室温静置30min,吸取200L于微量玻璃比色皿/96孔板，630nm测定光吸收，记为A测定管。AII活性计算公式：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算活性单位定义：37C中每亳克蛋白每分钟催化产生InmOl4-氨基酚为1个酶活单位。AH活性（nmolminmgpro）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T=2×（A测定管一A对照管）÷A标准管÷Cpr.（2）按样本质量计算活性单位定义：37°C中每克样本每分钟催化产生InmOl4-氨基酚为1个酶活单位。AH活性（nmol/min/g鲜重）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数?（WxV样）÷T=2×（A测定管一A对照管）+A标准管+WC标准品：10molL;V标准品：100L=1X104L：稀释倍数：V反总÷V上清液=300L÷100L=3:Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mgmL）,需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质:V样：加入反应体系中粗酶液体积，50L=0.05mL；T：催化反应时间（min）,30minob.使用96孔板测定的计算公式如下（1）按蛋白浓度计算活性单位定义：37°C中每毫克蛋白每分钟催化产生InmOI4-氨基酚为1个酶活单位。AH活性（nmolminmgpro）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T=2×（A测定管一A对照管）÷A标准管÷Cpr（2）按样本质量计算活性单位定义：37C中每克样本每分钟催化产生InmOI4.氨基酚为1个酶活单位。AH活性（nmol/min/g鲜重）=C标准品XV标准品X（A测定管一A对照管）÷A标准管X稀释倍数÷（WxV样）÷T=2×（A测定管一A对照管）-A标准管+WC标准品：10molL;V标准品：100L=IX10"L;稀释倍数：V反总÷V上清液=300L÷100L=3;Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mgmL）,褥要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒：W：样品质量；V样：加入反应体系中粗酶液体积，50L=0.05mL；T：傕化反应时间（min）,30mino
