酰基转移酶alcoholacyltransferaseAAT活性测定试剂盒说明书.docx

酰基转移酶(alcoholacyltransferase,AAT)活性测定试剂盒说明书微量法100管/96样注意t正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义：AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。测定原理：AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到醉，释放的COA还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率可计算AAT活性。自备仪器和用品：研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。试剂组成和配制：提取液：液体IOOmLXI瓶，4匕保存：试剂一：液体20mLxl瓶，49保存；试剂二：粉剂Xl瓶，20保存。试剂三：粉剂Xl支，4tC避光保存。粗酶液提取：1 .组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：510的比例(建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量(IO4个)：提取液体枳(mL)为5007000：1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min)；然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .液体：直接检测。AAT测定操作：1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到412nm,蒸馅水调零。2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入18mL试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后20保存，禁止反复冻融。3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇ImL充分溶解待用，用不完的试剂49保存。4、空白管：在EP管或96孔板中加入10L提取液和180L工作液，充分混匀，35反应151«加，加入10L试剂三，充分混匀，25C静置Iomin,测定412nm处吸光值，记为A空白管。5、测定管：在EP管或96孔板中加入10L样本和180L工作液，充分混匀，35C反应15min,加入10L试剂三，充分混匀，25C静置IOmin,测定412nm处吸光值，记为A测定管。AA=A测定管A空白管，空白管只要做一管。AAT活性计算：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1）按照蛋白浓度计算活性单位定义：每亳克蛋白每分钟催化产生InmoITNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/mgprot）=A÷（EXd）×V反总÷（V样XCPr）÷T=98.04×A÷Cpr（2）按照样本质量计算活性单位定义：每克组织每分钟催化产生InmOlTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/g鲜重）=ZkA+（CXd）XV反总÷（WxV样÷V样总）÷T=98.04xaA÷W（3）按细胞数量计算活性单位定义：每IO"个细胞每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmolmin104cell）=A÷（EXd）XV反总÷（细胞数量XV样÷V样总）÷T=98.04xaA÷细胞数量（4）按液体体积计算活性单位定义：每亳升样品每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/mL）=A÷（£：xd）×V反总÷V样÷T=98.04×A8：TNB消光系数，13600Lmolcm:d：比色皿光径：1cm：V反总：反应总体积，0.2mL：V样：加入反应体系中上清液体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL：Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量,g；T：反应时间，15min。b.使用96孔板测定的计算公式如下（1）按照蛋白浓度计算活性单位定义：每亳克蛋白每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/mgprot）=A÷（EXd）×V反总÷（V样XCPr）÷T=l96.08×A÷Cpr（2）按照样本质量计算活性单位定义：每克组织每分钟催化产生InmOlTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/g鲜重）=ZkA+（£xd）XV反总（WxV样÷V样总）=196.08xaA÷W（3）按细胞数量计算活性单位定义：每IO。个细胞每分钟催化产生InmolTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/104cell）=A÷（£xd）XV反总÷（细胞数量XV样÷V样总）÷T=196.08xaA+细胞数量（4）按液体体积计算活性单位定义：每亳升样品每分钟催化产生InmOlTNB定义为一个酶活单位。AAT（nmol/min/mL）=A÷（CXd）×V反总÷V样÷T=196.08×A8：TNB消光系数，l3600Lmolcm:d：96孔板光径：0.5cm：V反总:反应总体积,0.2mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，15min°