线粒体异柠檬酸脱氢酶ICDHm试剂盒说明书微量法100管96样.docx

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）试剂盒说明书微法100管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：ICDHm（EC1.1.1,41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三拨酸循中催化异柠檬酸生成酮戊二酸,同时将NAD+还原为NADH,是三粉酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。渊定原理：ICDHm催化NAD+还原生成NADH,导致34Onm处光吸收上升。需自备的仪器和用品紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：试剂一：10OmLXl瓶，20C保存；试剂二：20mL×l瓶，-20C保存;试剂三：ISmLxl支，-20C保存：试剂四：液体20mLxl瓶，4C保存；试剂五：粉剂Xl支,4匕保存;试剂六：粉剂Xl支，2（TC保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、称取约Slg组织或收集500万细胞，加入ImL试剂一和IOUL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将匀浆600g,42离心5min.3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmin。4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm（此步可选做）。5、在步骤的沉淀中加入200UL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W,超声3秒，间隔K）秒，重复30次），用于线粒体ICDHm活性测定。渊定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零。2、样本测定（1）在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解，置于374C（哺乳动物）或25（其它物种）水浴IOmin;用不完的试剂分装后-20°C保存，禁止反复冻融；（2）在试剂六中加入ImL蒸馆水，充分溶解待用：用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融；（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入IOUL样本、K）UL试剂六和180JL试剂五，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值Al和2min20s后的吸光值A2,计算4A=A2-A1。ICDHm活性计算：a.用微石英比色皿测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个衡活性单位。ICDHm活性(nmol/min/mgprol)=QAxV反总÷(×d)xl()9÷(CprxV样)÷T=16O8AA÷Cpr(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm(nmol/min/g鲜重)=AV反总÷(×d)xlO"÷(WxV样÷V样总)÷T=325AA+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm活性(nmolmin104cell)=AA'V反总÷(×d)xl()9÷(5(X)xV样÷V样总)÷T=0.65MAV反总：反应体系总体枳，2×104L；:NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm活性(nmol/min/mgprol)=QAxV反总÷(×d)×109÷(VW×Cpr)÷T=3216×A÷Cpr(2)按样本鲜重计算单位的定义：银g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个防活性单位。ICDHm(nmol/min/g鲜重)=A'V反总+(×d)xl04÷(WxV样÷V样总)÷T=650A+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。ICDHm活性(nmolmin104cell)=AA*V反总÷(×d)xl()9+(5(X)XV样÷V样总)÷T=L3'AAV反总:反应体系总体积，2×10-4L;:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。优利科(上海)生命科学褂限X