蔗糖磷酸化酶SucrosePhosphorylase,SP试剂盒说明书.docx

蔗糖磷酸化酶(SucrosePhosphorylase,SP)试剂盒说明书微量法100T/96S注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。澜定意义：SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖甘健，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP还能催化氢醍合成熊果件，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。渊定原理：SP能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生I-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6.磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NAD产生成NADPH,导致34Onm光吸收值增加。测定34Onm吸光度增加速率，即可计算SP活性。自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、恒温水浴锅、酶标仪、96孔板和蒸谣水。试剂组成和配制：提取液：液体IOomLXl瓶，4*C保存。试剂一：液体15mL×l瓶，4保存。试剂二：粉剂Xl支，20C避光保存，临用前加2.5mL蒸储水溶解；用不完的试剂分装后20七保存，禁止反复冻融。试剂三：粉剂Xl支，2(C避光保存，临用前加5mL蒸馈水溶解；用不完的试剂分装后2(C保存，禁止反复冻融。粗液提取：1 .组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：510的比例(建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液)进行冰浴匀浆，然后IOoOOg,4C,离心IOmin,取上清待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量(IO4个)：提取液体枳(mL)为5007000：1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min)；然后10000g,4C,离心IOmin,取上清置于冰上待测。渊定操作衰：1.晦标仪预热30min,调节波长至340nm02.操作表试剂名称对照管测定管试剂一(L)120120试剂二(L)2020试剂三(L)4040样本(L)20蒸饱水(L)20迅速混匀，于96孔板，37下测定34Onm的初始吸光值与反应2min后的吸光值，测定管记作Ai与A?»对照管记作A3与Ai,A=(A2-A)-(A4-A3)。SP活性计算公式，1.按照蛋白浓度计算Bl活定义：37°C,pH68时，每毫克蛋白质每分钟催化产生InmoINADPH为一个酶活单位。ASP活性(nmol/min/mgprot)=×V反总÷V样÷Cpr÷T=l608x4A÷Cpr×d2 .按照样本质量计算鼻活定义：37°C,pH68时，每克样本每分钟催化产生InmOlNADPH为个酶活单位。ASP活性(nmol/min/g鲜重)=XV反总÷(V样÷V样总xW)÷T=1608xaA÷W×d3 .按照细胞数量计算算活定义：37°C,pH68时，每IO,个细胞每分钟催化产生InmOlNADPH为个酶活单位。MSP活性(nmolmin104cell)=XV反总÷(V样÷V样总X细胞数量(万个)÷T=1608x4A÷细胞数量×d(万个)S：NADPH摩尔消光系数，6220Lmolcm;d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL：W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL：V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min注意事项：I.可选用BCA法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。2.样本较多时，可以按照每个样本试剂一：试剂二：试剂三=120：20：40(L)的比例配制工作液，用多少配多少，临用前立刻配制，10分钟内使用。优利科(上海)生命科学有RrJL