谷氨酸合成酶GlutamatesynthaseGOGAT试剂盒说明书微量法100管96样.docx

谷氨酸合成酶（Ghitamatesynthase,GOGAT）试剂盒说明书微量法100管/96样注意，正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：GoGAT广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。渊定原理：GoGAT催化谷翅酰胺的氨基转移到胡戊二酸,形成两分子的谷氨酸;同时NADH氧化生成NAD,34Onm吸光度的下降速率可以反映GOGAr活性大小。需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂组成和配制：提取液：液体IOomLXl瓶，4e保存：试剂一：液体20mLxl瓶，4保存；试剂二：粉剂x2瓶，4C保存：粗液提取：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入ImL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次）；8000g4C离心IOmin,取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：570的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4已离心IOmin,取上清，置冰上待测。渊定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零。2、样本测定（1）在试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀，置于37C（哺乳动物）或25°C（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后3h内用完）；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20PL样本和180UL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值Al和5min20s后的吸光值A2,计算AA=AI-A2。GOGT活性计算：a.用微量石英比色Jl溺定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmol/min/mgprot)=AA'V反总子(×d)×109÷(VW×Cpr)÷T=32I×A÷Cpr(2)按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。GoGAT(nmol/min/g鲜而)=QAxV反总+(×d)xl()9÷(WxV样÷V样总)÷T=32"AA+W(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmolminIO4cell)=AA'V反总÷(×d)xl()9+(50OXV样÷V样总)÷T=0.642AAV反总：反应体系总体枳，2×104L；:NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1)按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmol/min/mgpro()=AAxV反总÷(×d)×109÷(VW×Cpr)÷T=643×A÷Cpr(2)按样本鲜重计算：单位的定义：银g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmol/min/g鲜重)=QAxV反总子(×d)×I09÷(W×VW÷VW,.)÷T=643×A÷W(3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmolminIO4cell)=AAV反总子(×d)xl()9÷(500V样÷V样总)÷T=1.286><AAV反总:反应体系总体积，2×10-4L;:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。优利科(上海)生命科学有限X