猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法.docx
猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒3型(PorcineCircovirusType3,PCV3)的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)试验方法。本标准适用于猪圆环病毒3型的快速诊断、检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3原理聚合酶链反应或多聚酶链反应(POIynIeraSeChainReaCIiOrbPCR),乂称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。每完成一个循环需2min-4min,2h3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。4试剂和材料4.1 水：GB/T6682,一级水。4.2 蛋白酶K溶液(20mgmL)：配制见附录A.1。4.3 10%十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2)：配制见附录A.2。4.4 TriS平衡酚。4.5 三氯甲烷。4.6无水乙醇。4.7 70%乙醇:配制见附录A.3。4.8 0.5XTBE缓冲液：配制见附录A.4。4. 9电泳级1%X脂糖：配制见附录A.5o4.10DNA核酸染料。4. 11DNAMarker2000。5. 12引物：pi：5'-Taccacagaaggcgctatgtcg-S,；P2：5'-Atccgcataagggtcgtcttgc-S,。5仪器设备5.1 电子天平：感量为O.OOlgo5.2 微量移液器（最大量程分别为10UL、20M,、100UL、1000L）05.3 低温高速离心机。5.4 PCR仪。6. 5稳流稳压电泳仪。6.6 水平电泳槽。6.7 凝胶成像系统。6样品1.1 样品采集按NY/T5412016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和仔脏等器官组织。1.2 样品处理1.3 .1血清直接用于DNA提取。6. 2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1:5倍稀释，取悬液反复冻融3次，500Og离心15min,取上清液-20保存备用。7操作步骤6.1 病毒DNA的提取6.1.1 取上清液（或血清）500UL加入10%SDS溶液50uL>20mgInL蛋白酶K溶液10L,于55水浴2h3ho6.1.2 加入200LTriS平衡酚，混匀，412000g离心15min6.1.3 取上清液500UL,加入200IlLTriS平衡酚和200UL三氯甲烷，412000g离心15Inino6.1.4 取上清液400L,加入200IlL三氯甲烷，412000g离心15min.6.1.5 取上清液300UL,加入2倍体积的无水乙醇，-20静置20min,4eC12000g离心15min06.1.6 弃上清液，加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.1.7 加入20UL灭菌一级水溶解沉淀，-20保存备用。7. 2聚合酶链式反应（PCR）操作流程7. 2.1PCR反应体系配制按表1中1-7的循序配制。表1聚合酶链式反应体系1IOX反应缓冲液5.0HL2dNTP混合液(10molL)4.0HL表1聚合酶链式反应体系（续）3Pl(10molL)1.0HL4P2(10molL)1.0UL5DNA4.0PL6TaqDNA聚合酶(8UyL)1.0ML7灭菌水补足至总体积50.0UL7.2.2PCR程序设定每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照（用灭菌水作为模板），具体参数见表2。表2PCR反应程序设定温度时间194C4min294eC20s350C30s472r1min5重复步骤2440个循环672C5min7.3电泳操作电压100V电泳40min,并在凝胶中加入DNA核酸染料，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。8结果分析和判定电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现33ObP大小条带，阴性对照孔无特异性条带，则试验成立。在试验成立的条件下，若泳道扩增出大小为33ObP片段判为疑似阳性样品（说明样品中疑似含有猪圆环病毒3型），将目的条带进行序列测定，经序列分析后确认为阳性样品（说明样品中含有猪圆环病毒3型），无特异性扩增的泳道判为阴性。9试验材料处理9.1 病料的无害化处理对确诊为PCV3阳性的病料应采取深埋、焚烧等方法对病料进行无害化处理。9.2 试验材料处理对于PCR过程的废弃物应放置于专门处置危险废弃物的容器内，通过高压消毒等处理后达到生物学安全标准后才能运出实验室处理。附录A（规范性附录）试剂的配制A.1蛋白酶K溶液（20mgmL）蛋白酶K灭菌一级水100mg5mLA.210%十二烷基硫酸钠（SDS溶液,pH7.2）十二烷基硫酸钠灭菌一级水浓盐酸灭菌一级水10g80mL调PH至7.2加至100mLA.370%乙醇无水乙醇灭菌一级水70mL30mLA.40.5XTBE缓冲液TrisNa2EDTA.2H20硼酸灭菌一级水108g7.44g55g1L,配成IOXTBE缓冲液取IoXTBE缓冲液25mL,加灭菌一级水475mL,制成0.5倍的工作液。A.5电泳级1tX脂糖X脂糖0.5XTBE缓冲液0.6g60mL
