质粒提取常见问题解答.docx
质粒提取常见问题解答在一代测序或者去内毒素大提质粒时经常会发生一些质粒提取得率很低影响测序或大提质粒得率的情况。可从以下几种情况作出改善。第一种情况.没有提出质粒或者质粒收获量很低，可能原因如下：A菌种老化建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时（或者OD600不超过3.0）。B低拷贝质粒建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种BUffer的用量。C质粒丢失建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。D裂解不充分建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。EBUffer中有沉淀未溶解建议：BUfferBI和BUfferN1,BUfferCl在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37°C温育片刻，待溶液澄清后使用。FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。G离心柱中乙醇残留建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒大提，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片亥J(或置于65烘箱)，以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作。H洗脱液加入位置不正确建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。I洗脱液PH值不正确建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适PH值在7.08.5之间，如果洗脱液的PH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的日UtionBUffer(PH8.5,1OmMTriS-HCl)进行洗脱，如果用ddH20进行洗脱，请确保PH在7.0-8.5之间。J洗脱体积的选择建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。K洗脱时间的选择建议：加入洗脱BUffer后，室温放置25分钟，将有利于洗脱。第二种情况：质粒纯度不高A蛋白质污染建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddH20作为稀释溶液,测定OD比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer来稀释。BRNA污染建议:检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferAl中，加入RNaSeA后，BufferAl/RNaSeA应该存放在4,如果存放时间过长，或者没有正确存放，RNaseA活力下降，请重新加入RNaseAoC基因组DNA污染建议：加入BUfferBl后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入BUfferBl的处理时间最好不要超过5分钟。D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。
