谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px试剂盒说明书.docx

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书微法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。澜定意义：GSH-PX是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-PX不仅能够特异地催化还原型谷胱廿肽与ROS反应，生成氧化型谷胱廿肽GSSG,从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。渊定原理：GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH,产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG,再生GSH,同时NADPH氧化生成NAD产；NADPH在34Onm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、酶标仪、96孔板、和蒸储水。试剂组成和配置:试剂一：液体12OmLXl瓶，室温保存。试剂二：粉剂Xl瓶，4tC保存。试剂三：液体10Ll支，2（C保存。试剂四：液体200Lxl瓶，4保存。粗胸液提取：1 .组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：570的比例（建议称取约Slg组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g,4C离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：试剂一体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入ImL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体：直接测定。GSH-PX测定操作：1 .酶标仪预热30min,调节波长到340nm。2 .混合试剂在25或者37*C（哺乳动物）水浴中预热30min°3 .混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一20mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。（当天用完）4 .试剂四的稀释：吸取21.5L试剂四，加入5mL蒸饱水充分混匀，临用前配制，配制好的试剂当天使用。5.测定管：依次在96孔板中加入20L上清液、160L预热的混合试剂、20L稀释后的试剂四，迅速混匀后于34Onm处测定第30s和第210s的吸光值，分别记为Al和A2。4A测定管=Al-A2。GSH-Px活性计Jt:使用96孔板测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算GSH-Px活力单位定义：定温度中，每mg蛋白每分钟催化InmolNADPH氧化为1个院活单位。GSH-Px(nmol/min/mgprot)=A÷÷d×V反总xl4÷(CprxV样)÷T=1072×A÷Cpr(2) .按样本质量计算GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化InmolNADPH氧化为1个醉活单位。GSH-Px(nmol/min/g鲜重)=A÷÷d×V反总x1()9H(WXV样÷V样总)÷T=1072×A÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：一定温度中，每104个细胞每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px(nmolmin104cell)=A÷÷d×V反总xl04÷(细胞数量XV样样总)÷T=1072×A÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义：一定温度中，每亳升液体每分钟催化InmOlNADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px(nmolminmL)=A÷÷d×V反总xl4÷V样÷T=1072×A:NADPH摩尔消光系数6.22×103Lmolcm；d：96孔板光径,0.5cm：V反总:反应体系总体积,200L=2×104L；106：1mol=1×10ftmol:Cpr：上清液蛋白浓度(mg/mL)；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=2×10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。注意事项：(1)样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；(2)混合试剂和底物液须临用前配制，配完后置于冰上，当天使用完；(3)测定过程操作须迅速；(4)细胞中GSH-Px活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GSH-Px的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。优利科(上海)生命科学有限