猪疫病诊断技术 第1部分：圆环病毒_地方标准编制说明.docx

附件:猪疫病诊断技术第1部分：圆环病毒地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源2020年8月31日山东省市场监督管理局下发文件，关于公布2020年度省地方标准复审结果的通告（鲁市监通告（2020）71号），提出需要对DB37/T1827-2011进行修订。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施，由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。（二）起草单位、起草人及任务分工起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东信达基因科技有限公司起草人：李俊、时建立、李琛、刘畅、韩红、吴家强、吴晓燕、丛晓燕、孙文博、徐绍建、田瑶、杜以军、彭吉吉、马广斌、王方山、鹿洪伟、石灵南任务分工：李俊为标准制订负责人，组织标准制订起草工作，把握标准制订技术方向，组织协调标准制订所需资源。时建立、李琛、刘畅、马广斌和王方山协助组织讨论确定文件框架、编写思路,协助组织起草组人员讨论确定标准化对象需要规范的技术要素。韩红、吴晓燕和丛晓燕整理猪圆环病毒荧光PCR检测方法的相关资料和信息。孙文博、徐绍建、田瑶、鹿洪伟和石灵南确定试验任务，并在单位内部进行立项可行讨论和研究。吴家强、杜以军和彭吉吉修改完成标准征求意见稿，征求意见汇总处理，修改形成标准送审、报批材料等工作。（三）起草过程2021年1月-2021年4月：成立标准起草组，确定首席专家。并召开项目协调会，明确标准各项指标，分解检验测试等各项任务,并制定具体工作进度计划。2021年5月-2021年8月：标准制定小组组织召开标准起草组专题会议，进行阶段性总结，针对存在问题研究解决对策，并对标准部分内容进行调整。安排指标量化的比对试验和方法确定试验任务。2021年9月-2021年12月：收集、汇总、分析各类数据、资料，形成猪圆环病毒检测荧光PCR方法草案。2022年1月-2022年3月先后召开三次编写会，对内部专家评审意见进行研讨，对初稿进行修改，形成征求意见稿。2022年4月-2022年5月，征询外部专家意见。征求意见单位或专家涵盖行业协会、科研机构和高等院校共计30个，收到“地方标准草案征求意见稿”后，回函的单位或专家数共计30个，且收到“地方标准草案征求意见稿”后，回函并有建议或意见的单位或专家数共计30个，形成39条意见。经归类整理汇总形成征求意见汇总处理表。针对专家提出的建议，标准编制小组召开专题会议，认真研究讨论，对征求意见稿进行修改，形成标准送审讨论稿。同时委托山东省滨州市畜牧兽医研究院、山东省动物疫病预防与控制中心以及国家用动物保健品工程技术研究中心对标准草案中的标准技术指标进行验证。2022年6月-2022年12月，针对外部专家意见的进行修改和反馈。完成猪圆环病毒检测荧光PCR方法标准送审稿。2023年2月18日，山东省畜牧兽医局组织有关专家对该地方标准的标准送审稿和编制说明进行了会审。审查委员会听取了标准编制情况汇报，对标准文本进行了逐章、逐条审查，对标准编制说明等进行了审查。标准编制小组认真审阅，采纳了审查委员的意见和建议，形成了猪疫病诊断技术第1部分：圆环病毒标准报批稿。二、地方标准制定目的和意义猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒（PCV）引起的一种多系统性疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）,增生性坏死性肺炎（PNP）和繁殖障碍性疾病等，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，同时可以导致免疫抑制，进而导致继发或混合感染是国际公认的严重危害养猪业发展的疾病之一，对生猪生产造成巨大的经济损失。PCV是目前已知的能感染哺乳动物的最小病毒之一。迄今为止已经发现并鉴定了3种圆环病毒：PeV1、PCV2和PCV3oPCVl于1974年首次在体外培养的猪肾细胞系(PK15)中作为一种污染物被鉴定发现，对猪无致病性。1998年首次报道了从渐进性消耗性的病猪体内分离、鉴定的PCV2,并被陆续证实是PCVD的主要病原。目前针对PCV2检采用的电镜观察、ELlSA、IFA.PCR过程复杂，且过程繁琐、耗时长、特异性不强等给临床快速诊断带来极大不便。因此，发展一种操作简便、快速、高特异且灵敏的核酸检测方法对PCV2的预防和控制工作显得尤为重要。2011年团队制定的“猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术(DB37/T1827-2011)”地方标准获批，为PCV2的检测提供了一种操作简便、快速、高特异且灵敏的核酸检测方法。2015年，美国堪萨斯州立大学Palinski等首次检测发现PCV3。经检测排除了PeV2、PRRSV等其他常见病原体，故PCV3被认定为这些疾病发生的假定病原体。2017年团队率先发猪圆环病毒3型(PCV3)(感染率59.46%)在山东猪群中流行，且PCV3阳性猪群中存在TTSuVl(83.3%)和TTSUV2(71.2%)共感。截至目前全国已有26个省报道存在PCV3感染，阳性率呈逐年上升的趋势，且在部分母猪更新率较高、后备猪较多的猪场引发了较为典型的临床症状，造成较大的经济损失。目前，由于在我国越来越多的猪场检测出PCV3,并且PCV2感染在不同地区的规模化猪场中也相当严重且感染率逐年上升,同时分离鉴定PCV2时易受到PCVl的污染，因此非常有必要对猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术(DB37/T1827-2011)进行修订，针对PCV1、PCV2和PCV3建立诊断技术。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据3.1地方标准编制原则本标准内容的选取、格式等严格按照GB/T1.1标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的要求编写，力求结构严谨，文字简洁易懂，逻辑清晰，引用文件规范、准确。3.1.1科学性本标准编制内容是以大量的国内外PCV检测方法为基础，结合不同型间PCV基因组的差异性特点，通过大量的实验数据对比分析进行编写。制定本标准时充分考虑了标准的可操作性，制定过程中搜集相关资料，进行严格的比对分析，保证本规范简单易行，便于操作。并且委托山东省滨州市畜牧兽医研究院、山东省动物疫病预防与控制中心以及国家用动物保健品工程技术研究中心对标准草案中的标准技术指标进行验证，验证结果一致。3.1.2先进性本标准编制内容完整、精炼，通过自行设计特异性引物，提取病毒DNA后利用荧光定量PCR方法检测猪圆环病毒不同亚型毒株,该快速诊断方法与现有技术相比具有很强的特异性、敏感性、重复性，且与普通PCR方法相比敏感100倍，时间也缩短一半多，具有快速和可操作性强的特点。3.1.3系统性以我国现行技术规范为基础，在猪圆环病毒不同亚型的检测、病料及材料的无害化处理要求上协调一致，同时又充分体现该技术标准的特点及适用范围3.1.4适用性本标准可广泛适用于猪血清和组织中猪圆环病毒1型、2型和3型的快速鉴别检测、血液、组织脏器及材料的无害化处理3.2标准主要技术内容本标准根据GenBank中已经发表的PCVhPeV2、PCV3的全基因组序列设计合成多对特异性引物，经过筛选后确定能分别扩增164bp、196bp、193bp片段的特异性引物，建立了PCVKPCV2、PCV3SYBRGreenI实时荧光定量PCR鉴别诊断方法。研究结果表明该方法具有良好的特异性，与CSFV.PRRSV、PRV.PPV无交叉反;敏感性试验检测下限分别为PCVL40.3拷贝LPCV2：19.7拷贝LPeV3:22.4拷贝L,优于普通PCR的灵敏度100倍;3次批内及批间重复的变异系数都低至1%以下。对组织和血清样品检测表明，该方法可以准确鉴别检测PCV。本标准所建立的检测方法敏感性高、特异性强、具有稳定的可重复性，可用于对PCV1、PCV2、PCV3临床感染率的调查、定量检测及后期研究。3. 3标准主要内容确定的依据3.3. 1引物的设计根据NCBlGenBank己发表的PCVKPCV2、PCV3的ORFl基因序列，利用PrinIer5.O软件经过筛选设计分别针对PCV1、PCV2、PCV3的特异性引物（表1）,PCVhPeV2、PCV3采用一条公共的上游引物。该引物特异性强，可特异性扩增猪圆环病毒不同亚型。表1PCVKPCV2、PCV3引物引物序列PCV-FTkgatgatyttttatggstggPCVl-RGtcagcagttgaggactaccattPCV2-RAgtaatccgccgataaagagcPCV3-RCtcctaaacaaggcctccaact3.3.3标准曲线和溶解曲线的建立选取10卜9拷贝/UL的重组质粒进行荧光定量PCR反应，利用软件分别自动生成的PCV1、PCV2、PCV3标准曲线（图1）和溶解曲线（图2）。可以得出PCV1、PCV2、PCV3拷贝数（x）与循环阈值（Ct）两者呈现线性关系，曲线表达式分别可以表示为Ct=-3.096lgx+38.846R2=0.9992；Ct-3.356lgx+39.513R2=0.9999;Ct=-3.611lgx+40.783R2=0.9998oPCVLPCV2、PCV3熔解温度分别约为83.5、85、81.5oCo阴性对照无熔解温度峰值，而PCV1、PCV2、PCV3标准品模板经过荧光PCR反应都只有单峰，波峰之间吻合度高，说明曲线建立过程中模板没有出现污染，结果具有可信度。466Log Concenlfation2»2&24-空2(>伶 d OiBeW(B)£od D4IISC2。Standard Curve 30:Log ConccntrMionLog Concentration& S 42-d>tb 2222211 x5d 0图1荧光定量PCR标准曲线(A)PCVl标准曲线：斜率：-3.096；相关系数(R2) : 0.9992； (B)PCV 2标准曲线:斜率：-3.356;相关系数(R2) : 0.9999; (C)PCV 3标准曲线：斜率：-3.611；相关系数(R2) ： 0.9998.777777777772232052S272&92O21222987 & WS4122J1.Q5s图2荧光定量PCR溶解曲线1：PCV3TM=81.5±0.5°C；2:PCVlTM=83.5±0.5七；3:PCV2TM=85±0.53.3.4敏感性试验对IOi-IO"个稀释度的标准样品进行敏感性试验，结果表明，本研究建立的检测方法最低检测下限分别为PCV1：40.3拷贝/uL（图3A）、PCV2：19.7拷贝/uL（图4A）、PCV3：22.4拷贝/U1（图5A）,而普通PCR扩增时最低检测下限分别为PCV1：4.03×IO3拷贝ul（图3B）、PCV2：1.97×IO3拷贝uL（图4B）、PCV3：2.24×IO3拷贝uL（图5B）。结果说明：本研究建立的检测方法比常规PCR敏感两个数量级。(A)(B)（A） 19标准质粒稀释浓度：4.03×108-4.03×101拷贝h阴性对照；（B） M： DL2000DNA Marker； 17标准质粒稀释浓度：4.03xl08-4.03xl（）3拷贝k阴性对照67(B)(A)Aattft>tl C*vtM 1234567bp20001000750500250100图4PCV2敏感性检测（八）18标准质粒稀释浓度：L97xl7.97xl拷贝他、阴性对照;(B)M:DL2000DNAMarker；17标准质粒稀释浓度：1.97xlOjM.97xl()3拷贝加、阴性对照(A)(B)（八）19标准质粒稀释浓度：224xl08-224xl0拷贝侦、阴性对照;(B)M：DL2000DNAMarker；17标准质粒稀释浓度：2.24×108-2.24×103拷贝h阴性对照3.3.5 特异性试验以CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCVhPCV2、PCV3等核酸为模板,RNA病毒CSFV和PRRSV需要先进行反转录cDNA过程。加入阴阳性对照和各核酸的模板后进行反应。结果显示，只有PCV1、PeV2、PCV3有荧光信号，其他4种病以及阴性对照均没有出现扩增，说明本标准建立的荧光PCR方法具有很好的特异性（图6）图6荧光定量PCR特异性试验1-8:PCVUPCV2、PCV3、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、阴性对照3.3.6 重复性试验对PeV1、PCV2、PCV3拷贝数为105>10、10,拷贝/uL的标准样品批内和批间分别进行3次重复。计算并分析3次重复试验循环阈值的平均值、标准差和变异系数（表2）o经过计算1010;IO?稀释度的标准品变异系数都小于LOO%,表明本研究建立的检测方法可重复性高，本标准方法可用于进行荧光PCR方法诊断PCV1、PCV2、PCV3o表2荧光定量PCR重复性试验结果病毒标准品浓度复数重次批内重复试验批间重复试验XScv%XScv%4.03×IO5320.060.030.1520.050.110.55PCVl4.03XlO4323.520.060.2523.540.050.084.03×IO3326.330.080.3026.300.120.091.97XlO5320.720.090.4320.860.070.34PCV21.97×IO4323.880.040.1723.820.180.751.97XlO3327.120.050.1827.160.030.112.24XlO5320.790.070.3320.700.160.77PCV32.24XlO1323.620.030.1323.790.040.172.24×IO3326.900.020.0727.090.180.663.3.7 临床样品检测试验对98份疑似PCV的病料进行荧光定量PCR检测，PCV扩增阳性感染率分别为PCVl：102%(10/98)、PCV2：65.3%(64/98)、PCV3：53.1%(52/98),共感染率为7.1%(7/98)。而常规PCR扩增结果显示感染率分别为PCVl：7.1%(7/98)、PCV2：59.2%(58/98)、PCV3：43.9%(43/98),共感染率为5.1%(5/98)。临床检查结果说明，荧光定量PCR比常规PCR灵敏度高(表3)。表3荧光定量PCR临床检测结果统计类型PCVlPCV2PCV3混合感染荧光定量PCR10/98(10.2%)64/98(65.3%)52/98(53.1%)7/98(7.1%)普通PCR7/98(7.1%)58/98(59.2%)43/98(43.9%)5/98(5.1%)四、与现行相关法律、行政法规和其他标准的关系本标准不存在与现行法律、行政法规、强制性标准冲突或不协调的内容。本标准起草时参考了中华人民共和国农业行业标准NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范、GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法、GB19489实验室生物安全通用要求等。五、重大分歧意见的处理过程、处理意见及其依据本标准在编制过程中没有重大分歧。六、对地方标准自发布日期至实施日期之间的过渡期的建议及理由本标准没有关于对地方标准自发布日期至实施日期之间的过渡期的建议。七、其他需要说明的内容关于本标准名称变更说明。2023年2月18日山东省畜牧兽医局组织有关专家对该地方标准的标准送审稿和编制说明进行了会审。根据审查委员的意见以及按照GB"1.1要求，将标准名称“猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术”，更改为“猪疫病诊断技术第1部分：圆环病毒”。提出部门（盖章）年月日