疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤.docx

疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10100mgml)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖CL-4BNaCl硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。1 .装填5ml苯基琼脂糖CL-4B进入柱内；2 .10倍柱床体积层析缓冲液(20mmolL,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3 .调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。上样总蛋白量200-500mg；4 .3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5 .用分步梯度法洗脱。每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6 .再依次用5倍体积水、5倍体积1mol/LNaCl和5倍体积水洗柱，使其获得再生。