酶工程 作业.docx
1.自然酶一般总是处于最佳构象状态吗？举例说明。答：胰蛋白酶酶原，用肠激酶或胰蛋白酶进行修饰，切除一个六肽，从而显示胰蛋白酶的催化功能。天冬氨酸酶经过胰蛋白酶修饰，从C末端切除10多个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5.5倍。这说明自然酶并不总是处于最佳构象状态。A.自然酶的活性维持存在缺陷：（如：异体蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性半衰期短）B.自然酶的使用性能存在缺陷：（如：酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活力量差，简单受产物抑制）C.自然酶的应用存在潜力。（如：通过酹的分子改造可提高前的稳定性、解除酶的抗原性、转变酶学性质（最适pH、最适温度、Km值、催化活性和专一性等）、扩大酶的应用范围）2 .对酶分子主链进行切断修饰之后，可能会消失哪些状况？答：A.主锥切断后，醮活性中心遭到破坏、醉失活。这种修饰主要用于探测酶活性中心的位置。B.主链切断后，仍可保持酶活性中心的构象，酶的催化功能可以保持不变或损失不多，同时辞的抗原性降低或消逝。C.有些酶蛋白具有抗原性。酶的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往有较强的抗原性，而小分子蛋白或肽段的抗原性较低或无抗原性。3 .酹分子侧链基团一般包括哪些基团，侧链基团修饰的目的意义？答：睡蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、装基、筑基、胭基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。凡能使蛋白质侧链上的氨基发生转变的化合物，称为氨基修饰剂，主要有亚硝酸、二硝基氟苯、醋酸酎、琥珀酸酎、二硫化碳、乙亚胺甲酯。0甲基异朦、顺丁烯二酸SF等。氨基修饰剂可以使侧链氨基发生脱氨基作用，或者与氨基共价结合将氨基屏蔽起来常用的装基修饰剂有：碳二亚胺、乙醇一盐酸试剂、异恶哩盐等。其中水溶性的碳二亚胺类特定的修饰醵的较基已成为最普遍的标准方法，它在比较温柔的条件下就可以进行。蛋白质分子中精氨酸残基的侧链是肌基。采纳二段基化合物与胭基反应生成稳定的杂环转变薛分子的性质和结构的方法称为服基修饰。胭基修饰剂有：环己二胡、丙二醛、苯乙二醛等。 魂基在维持亚基间的相互作用和酶催化过程中起重要作用，流基具有很强的亲核性，在含有半胱氨酸的酣分子中是最简单反应的侧链基团。已经开发了很多修饰筑基的特异性修饰剂。其中EIIInan试剂DTNB,5节二硫代-双（2-硝基）苯甲酸是最常用的筑基修饰剂，可以对醵分子中疏基的数目进行定量，用于讨论筑基转变程度和筑基所处的环境以及蛋白质的构象变化。 修饰酶蛋白酪氨酸残基的酚环。有硝化法，琥珀酰化法、碘化法等。组氨酸残基位于很多酶的活性中心，常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸。DP瓶近中性的PH下对组氨酸残基有较好的专一性，产物在24Onin处有最大汲取，可跟踪反应和定量。 近年来，设计了一些对称的“双头”试剂，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间搭桥，形成多肽链内的交联，而不引起蛋白质构象的重大转变，这种试剂称为双功能试剂。如戊二醛、乙二胺、二氯基丁烷等O双方能K剂E子淘春功能基团的"应活性，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或醒与其它分子之间发生交联反应。4.何谓分子结合修饰，有哪些方面的作用？答：A.使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地爱护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖甘等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而爱护酹的活力。B.一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调整酶的微环境来爱护酶的活力。C.另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排解了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了（1）提高酸活力（2）增加酶的稳定性（3）降低抗原抗体反应5 .何谓分子内交联修饰，有哪些方面的作用？答：分子内交联修饰近年来，设计了一些对称的“双头”试剂，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间搭桥，形成多肽链内的交联，而不引起蛋白质构象的重大转变，这种试剂称为双功能试剂。如戊二醛、乙二胺、二氨基丁烷等双功能试剂分子两端功能基团的反应活性，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其它分子之间发生交联反应。6 .何谓氨基酸置换修饰，有哪些方面的作用？答：将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。1）通过修饰可以提高酶活力2）通过修饰可以增加酶的稳定性3）通过修饰可以使酶的专一性发生转变7 .酶分子的物理修饰有什么特点，有什么用途？答：A.通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特殊是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端PH值等）由于酶分子空间构象的转变而引起酶的特性和功能的变化状况。B.特点在于不转变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生转变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。C.高压处理纤维素酶，该酶的最适温度有所降低，在30C40C条件下，比自然酶的活力提高10%；天冬氨酸甲酰转移酶在12000Pa压力下处理以后，酶活力提高三倍。D.高压处理甚至可转变酶的底物专一性。救肽酶V经高压处理，底物专一性发生转变。其水解力量降低，而有利于催化多肽的合成反应。天冬氨酸酶经高压处理肯定时间后，可以催化D-Asp的氨解反应。一般认为，蛋白质在压力的影响下，会转变它的体积、构象及活性部位。E.醵分子空间构象的转变，可以在某些变性剂的作用下，破坏原有的空间构象，然后在不同的物理条件下，酹分子重新构建新的空间构象。例如：胰蛋白酶用盐酸服处理，破坏蛋白质的副键，肽链充分伸展，原有的空间构象被破坏。然后，透析除去变性剂，再在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明，在20C条件下，重新构建的胰蛋白酶与自然胰蛋白酶的稳定性基本相同；而在50C条件下重新构建的酶，稳定性比自然酶提高5倍。8.何谓金属离子置换修饰？方法步骤？主要的应用？ 把薛分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生转变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 -淀粉酶中的钙离子（CaM）,谷氨酸脱氢酶中的锌离子（Zn2+）,过氧化氢酶分子中的铁离子（Fe,酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn"）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子（CUZn, 若从醉分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丢失其催化活性。假如重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若另一种金属离子进行置换，则可使醒呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丢失，有的却可以使醒的活力提高或者增加酶的稳定性。a.酶的分别纯化：首先将欲进行修饰的薛经过分别纯化，除去杂质，获得具有肯定纯度的酶液。b.0除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入肯定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酹液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。c.加入置换离子：于去离子的酹液中加入肯定量的另一种金属离子，醒蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。9 .何谓多酶融合体？答：很多真核生物的多酶体系是多功能蛋白，不同的酶以共价键连在一起，称为单一的肽连，称为多酶融合体。10 .薛分子的主链修饰包括哪几个方面的内容?何为醉分子的主链剪接修饰？答：1.主链的切断修饰2 .主链连接修饰一一多酶融合体3 .主链剪接修饰采用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些转变，从而转变酶的特性和功能的方法。通过主链修饰，可以知道醵活性中心在主链上的位置，了解主链不同位置对酹催化功能的贡献。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。
