HPTM 高效蛋白裂解液.docx
产品编码：GF-OOl(GF取GeneFUnbio)产品名称：HP高效蛋白裂解液（HP¢（highperformance）晶凡（上海）生物技术公司出品的HPTM高效蛋白裂解液是一种高效的细胞组织总蛋白抽提缓冲液。随裂解液同时配送蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（100倍稀释使用）。该裂解液对于抽提细胞核蛋白和多次跨膜蛋白具有极好的效果，该裂解液裂解得到的蛋白样品可以兼容BCA等定量方法，主要用于常规的Westernblot分析，含磷酸化蛋白等（参考文献17）。对于IP实验，我们将提供专门的针对细胞膜蛋白、细胞核蛋白和胞浆蛋白的抽提试剂和解决方案。保存条件该裂解液中未添加叠氮钠等防腐剂，4保存半年内有效。也可以分装20保存,一年有效。蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂需放置-20保存。注意事项：1 .为取得最佳的使用效果，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。考虑到使用方便，我们已经分装成小份（IOoUL一只）2 .裂解样品的所有步骤都需在冰上或4进行。3 .为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明：对于培养细胞样品：1 .取出HPTM高效蛋白裂解液,轻轻混匀,避免大幅度摇晃；如果是分装样品，室温溶解，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（100倍稀释）。例如：10毫升HPTM高效蛋白裂解液各加100微升的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。置冰上备用。2 .对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液快速冲洗2-3遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗）。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例（有些时候，处理的条件要求细胞密度低，可以调整为80微升，下同；或者换成60/100毫米的皿）加入裂解液。慢慢晃动培养皿或板，使裂解液和细胞充分接触（观察到液体流过整个皿底）。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。通常室温低于25度时，裂解过程可以不必放冰上，整个过程控制在10分钟。可以置于摇床上轻摇，裂解10分钟。3 .对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。用PBS、生理盐水或无血清培养液洗涤2次，离心收集细胞，吸干或空干液体，注意不要使细胞随液体流失（动作要领为倒液体时要连续性，不要折返回来）。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解10分钟。4 .将裂解物收集到离心管，超声2个5秒。超声处理可以促进蛋白溶解和剪切核酸，尤其是对于膜蛋白的抽提很必要。没有超声仪器的，可以改用皮试针头吸打几次也会达到效果。5 .充分裂解后，12000-15000g离心10分钟，取上清，即可进行后续的BCA定量、PAGE、WeStembIOt等操作。BCA定量蛋白浓度大约为3000-5000微克每毫升。6.1, 取BCA定量样品后的上清样品加1/2体积的3×SDSloadingbuffer,沸水浴煮3-5分钟，冰上放置数分钟后-20保存。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。按照不同细胞密度、不同细胞类型进行微调。对于组织样品：1 .取出HPTM高效蛋白裂解液，轻轻混匀，避免大幅度摇晃；如果是分装样品，室温溶解，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（IoO倍稀释）。例如：10毫升HPTM高效蛋白裂解液各加100微升的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。置冰上。2 .冰冻组织快速取出称重。这时候最好是放在2或5毫升离心管，便于下面的组织剪碎。对于脑组织等不需要剪碎的样品组织，可以直接放到玻璃匀浆器里3 .按照每100毫克组织加入1-2毫升裂解液的比例（湿重组织的1:10-20）快速加入裂解液。如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。4 .把组织剪切成细小的碎片。5 .用电动或玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。对于脑组织来说，玻璃匀浆器通常上下10-20次即可。注意温度，如果室温超过25度时，可以在冰上插管用电动匀浆器或在玻璃匀浆器套管中加入碎冰。匀浆后马上吸取液体到离心管，插冰上放置10-15分钟。中间每隔3-5分钟混匀一下。这期间可以进行下一步的超声处理。6 .将裂解物收集到离心管后，可以马上超声2个5s。超声处理可以促进蛋白溶解和剪切核酸，尤其是对于膜蛋白的抽提很必要。没有超声仪器的，可以改用1毫升枪头反复吸打多次也会达到效果。7 .充分裂解后，12000-15000g离心10分钟，取上清，即可进行后续的BCA定量、PAGE、WeStemBIot等操作。8 .如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈VorteX使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是没有使用匀浆器那样裂解得比较充分。9 .抽取BCA定量样品后的上清样品加1/2体积的3×SDSloadingbuffer,沸水浴煮35分钟，冰上放置数分钟后20C保存。注：如果没有使用超声步骤，裂解产物中有时候可能会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB.p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。参考文献：1. DingMHetal.,ThetransducibleTAT-RIZ1-PRproteinexertshistonemethyltransferaseactivityandtumor-suppressivefunctionsinhumanmalignantmeningiomas.Biomaterials2015Jul;56(3):165-178.doi:10.1016j.biomaterials.2015.03.058.2. DaiYKetal.,Alinkbetweenthenuclear-localizedsrGAP3andtheSWI/SNFchromatinremodelerBrgl.MolCellNeurosci.2014May,60:10-25.3. TuYetal.,MicroRNA-218InhibitsGliomaInvasion,Migration,ProliferationandCancerStem-IikeCellSelf-renewalbyTargetingthePolycombGroupGeneBmil.CancerRes.2013,Oct1;73(19);6046-55.4. JinWLetal.,IntraneuronallocalizationofNogo-Aintherat.JCompNeurol.2003Mar24;458(1):1-10.5. ChenKetal.,Thementalretardationassociatedprotein,srGAP3negativelyregulatesVPA-inducedneuronaldifferentiationofNeuro2Acells.CellMolNeurobiol.2011Jul;31(5):675-86.6. MiYJetal.,Amino-Nogo-Aantagonizesreactiveoxygenspeciesgenerationandprotectsimmatureprimarycorticalneuronsfromoxidativetoxicity.CellDeathDiffer.2012Jul;19(7):1175-86.7. MaYetal.,TheinverseF-BARdomainproteinsrGAP2actsthroughsrGAP3tomodulateneuronaldifferentiationandneuriteoutgrowthofmouseneuroblastomacells.PlosOne.2013Mar7;e57865.
