丛枝菌根真菌生产技术规程.docx
丛枝菌根真菌生产技术规程1范围本标准规定了丛枝菌根真菌生产技术的术语和定义、环境条件、丛枝菌根真菌样品采集、丛枝菌根真菌抱子的分离提取、单胞培养、扩繁培养、收获菌种及生产档案。本标准适用于丛枝菌根真菌菌种生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB15618土壤环境质量标准农业地土壤污染风险管控标准（试行）GB5084农田灌溉水质标准GB/T32721-2016污染物对菌根真菌的影响泡子萌发试验NY/T11132006微生物肥料术语3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1丛枝菌根真菌能与植物根系形成丛枝菌根的真菌。3.2抱子真菌的无性繁殖体。3.3抱子果菌丝体包被的抱子群。3.4菌丝体菌丝分枝后的网状结构。3.5菌丝菌丝体的丝状结构。3.6单狗培养利用湿筛分离技术分离出纯净的抱子,并将一个胞子再次接种于扩繁宿主植物幼苗根部以获得单一菌种的方法。3.7扩繁培养将单抱分离后的培养物和扩繁宿主植物一起接种于灭菌的沸石、河沙混合基质，浇灌霍格兰茨（Hoagland）营养液，培养后可获得其加富培养物。4环境条件土壤环境质量应符合GB15618的规定，空气环境质量应符合GB3095的规定，农田灌溉水质应符合GB5084的规定。5丛枝菌根真菌样品采集9月底10月初，选取长势良好目标植物，去掉地表大块沙石和其它杂物，用铁锹或小铲沿植物周围往下挖，取样深度OCm30cm,尽量将整个根系挖出，剪去植物地上部分，连根带土大约2kg装入塑料袋。6丛枝菌根真菌胞子的分离提取湿筛倾析法分离提取抱子。土壤样品20g50g放进食品搅拌机杯，加入60OmI水，高速转3s5s0对于黏性或结块较大土壤，先在水中浸泡20min30min°打碎的材料倒出，依次通过3个土壤标准筛（上层孔径0.8mm,中层孔径0.25mm,下层孔径0.055mm）。用流水冲洗每层筛子，直至流出的水是清水。上层筛大抱子洗涤、转移到大培养皿，在体视显微镜下观察。下层筛子残余物转至50ml含有20%60%蔗糖梯度的离心管中离心，3000rmin离心2min3min.离心管中上清液倒至较小筛子，用水冲洗Inlin_2min,转移至玻璃培养皿，在体视显微镜下用解剖针和毛细吸管将胞子与有机碎屑分离，按形态分开胞子，放入置于培养皿的表面皿，或有盖瓶中，4下存放48h以上。复检挑出并丢弃变色、有斑、内含物异常、过度透明或抱子表面有细菌或真菌生长的狗子。换水，将抱子贮于4下24h48h再次检查典型抱子，根据抱子的颜色、大小、抱子果等形态特征将抱子分类，水洗并转移至放有灭菌蒸储水的表面皿中备用（不长于7d）。7单抱培养7.1 培养基质沸石和河沙按1:1混合，装布袋，在105C下蒸汽灭菌lh2h,间隔24h重复1次，放置7d14d后使用。7.2培养容器50穴苗盘，54cm×28cm×10cm,每穴容积约IlOCm可以整盘使用，也可以剪开成排或单独使用。使用前用10%次氯酸钠浸泡30min,清洗，淋干。7.3 宿主植物高粱，播种前将种子在40%甲醛1:100的溶液中浸泡15min,用水冲洗数次。7.4 单胞培养流程装入灭菌的沸沙培养基质至每穴2/3处。体视显微镜下用毛细吸管吸取新鲜、光亮、饱满的抱子滴放在装好的基质上，力InCm2cm的灭菌沸沙培养基质于他子上，表面播种高梁种子2粒3粒，覆盖0.5Cm灭菌基质，浇水，移至光照室或温室培养90d120d.8扩繁培养8.1 培养基质同7.1。8.2 培养容器普通塑料花盆，高度IoCm25cm,用10%次氯酸钠溶液浸泡30min,清洗，淋干。也可以用70%75%的乙醇溶液浸泡或擦拭。8.3 宿主植物玉米，播种前将种子在1%胆。2消毒IonIin,用蒸储水清洗干净后浸泡4h于培养箱中28°C催芽。8.4 扩繁培养流程将单泡培养苗盘中的高梁苗与培养物一起取出，放在已消毒的塑料（或者PvC）盘中，用灭菌的刀切取1/4,进行湿筛，在体视显微镜下检查衔子、菌丝及根系侵染。将灭菌的沸沙培养基质装至塑料盆的1/3处，将上述检查后确定己有侵染的剩余3/4培养物与高梁苗，直立于塑料盆中心位置，周围再填满灭菌的沸沙培养基质，浇水，每盆播种玉米种子2粒4粒，覆盖ICm2cm灭菌基质，移至光照室或温室培养120d150d.8.5 扩繁培养营养液霍格兰茨（Hoagland）营养液配置见表1,每7d浇1次营养液，每升基质1次使用50m70mL如果观察到缺乏营养的现象时连续浇营养液2d3d.«1霍格兰茨（HOagIand）营养液配方成分母液浓度（gL）营养液浓度（mlL）KH2POi1361KNO11015Ca(NoJ)?2365MgSO1246.52H1BOj2.861MnCl2.4112O1.811ZnSO1.7H200.221CuSO1.5】LO0.081H2MnO1.H2O0.021FeEDTA(即TAFeSOl.7H20)7.455.5718.6扩繁培养光照使用LED植物补光灯，每天补光4h6h°8.7 扩繁培养温度培养室温度维持在15°C30°Co8.8 扩繁培养湿度使用pH6.57.5的自来水浇水，基质含水量保持在田间持水量的55%65%°浇水容器不应接触到培养基质表面，浇水时基质或水不应泼溅到外面，以免造成盆与盆间菌种的污染。9收获菌种先剪去植株地上部分茎叶，将盆置于温度湿度相对稳定的房间内干燥7d14d,收获盆中包括植物根系、菌丝、孩子和基质所有培养物。10生产档案应建立生产档案，内容包括：丛枝菌根真菌样品采集、丛枝菌根真菌孩子的分离提取、单抱培养、扩繁培养和收获菌种。
