饲喂葡萄籽超微粉对小白鼠健康状况的影响技术报告.docx

饲喂葡萄籽超微粉对小白鼠健康状况的影响技术报告“饲喂葡萄籽超微粉对小白鼠健康状况的影响（项目编号:2019NS091）”是由泰山学院承担的泰安市科技发展计划（引导计划）项目，于2019年立项。2021年6月项目实施完成，现将项目实施情况总结如下：一、项目名称饲喂葡萄籽超微粉对小白鼠健康状况的影响二、项目来源本项目源自泰安市科技发展计划（引导计划）项目“饲喂葡萄籽超微粉对小白鼠健康状况的影响“，于2019年立项。三、主要研究内容（1）葡萄籽超微粉的制备方式研究葡萄籽超微粉的制备首先需要除去葡萄籽中的油类，油类去除有有机溶剂去油、冷榨、热榨三种方式，研究不同去油方式对葡萄籽超微制备率、粒径、组分的影响，确定合理的去油方式。（2）、不同制备方式获得的超微粉的抗氧化能力研究（3）、葡萄籽超微粉不同饲喂方式对小白鼠健康状况的影响该研究采用的体内方法通过小白鼠喂养实验，测定其体内各相关指标的变化，例如：血液、胆固醇、肝指数等。四、技术方案及研究方法4.1取样葡萄籽由泰山学院2019年酒精发酵结束后的干红葡萄酒皮渣中获得，葡萄品种为新疆赤霞珠。4.2试验方法4.2.1 酿酒皮渣处理在室外干净无遮挡的地面上铺竹席，将新鲜酿酒葡萄皮渣（若不能及时处理，需要冷冻储藏）晾晒在竹席上，经过5天室外晾晒（期间均是晴天，温度不超过30）,晾晒过程中每天翻3次皮渣，晒干的皮渣拿木板敲击，使皮籽分离，借助风力，分离出葡萄籽。将葡萄籽用清水洗3遍，在烘箱中40,24h烘干。将葡萄籽切开，于105烘至恒重，测定葡萄籽含水率，使其含水率在78%。处理完的葡萄籽，装在聚乙烯自封袋内，避光，4保存。4.2.2 葡萄籽去油处理4.2.2.1 冷处理本试验用KOMET冷榨机，加工过程灵活，能迅速更换种子。榨油前，葡萄籽不经粉碎及加热，直接进料。先用Ikg葡萄籽润洗榨油机，每次用所榨品种的葡萄籽“润洗”榨油机，避免不同品种葡萄籽油混杂。取5kg葡萄籽榨油，用锡纸包裹的广口瓶收集毛油。榨油产生的饼粕待降至室温后，装入聚乙烯自封袋内，避光，-40放置12h。取50Og饼粕，按35gkg比例加入微晶纤维素混合后，在超微粉碎机中-20粉碎25min,获得饼粕超微粉（李华等2007）。为获得单品种葡萄籽饼粕超微粉，每次正式超微粉碎前第一次用该品种葡萄籽饼粕进行超微粉碎，可视为“润洗”，第二次超微粉碎的饼粕超微粉装入聚乙烯自封袋内，避光，-40保藏备用。4.2.2.2 热处理将葡萄籽洗净、105°C烘至恒重，粉碎至80目筛通过率大于95%,加入适量盐酸，置于水浴处理一段时间；冷却至室温后，加入一定量石油酸，充分振荡一段时间后，8000rmin>4离心5min,取石油酸层，剩余部分加入等体积的石油酸再次萃取、离心，取石油酸层合并；加入与合并石油酸层等体积0.1%的NaCl溶液，混匀、离心，弃石油酸层，获得葡萄籽超微粉。4.2.2.3 有机溶剂提取对葡萄籽进行粉碎，IOs/次，粉碎10次。向粉碎的葡萄籽中加入乙醇水溶液，加热，当达到设定温度时，使用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH,反应结束后5000r/min离心15min后，得到清油、水相和渣相。4.2.3 葡萄籽超微粉总酚的提取称取LOOOg饼粕超微粉，加IOmL石油酸混匀，60%功率超声提取30min,期间每隔5min混匀一次；IOoOOrmin离心IOmin,去掉上清，向沉淀中加入IOmL石油酸，再重复2次；将去油后的超微粉放在通风橱中，等待石油醒完全挥发掉；向去油后的沉淀中加入20mL80%甲醇，40%功率超声30min,然后I(XMX)IVmin离心IOrnin,收集上清液于避光广口瓶中，再重复2次，合并3次所有上清液摇匀，-40避光保存待用。4.2.4 葡萄籽超微粉总酚含量的测定总酚含量(TPC)的测定参照SingIetOnetal.,(1999)中描述的FOIin-CioCaIteU法进行，稍作修改，具体操作步骤如下：将2mL样品放置于5mL离心管中，如果浓度过高，用超纯水进行适当稀释；将ImL不同浓度的没食子酸或样品加入15mL的玻璃试管中；向每支试管中加入ImLFoIin-CioCalteU试剂，手动混匀，室温静置Imin；向每支试管中按顺序分别加入3mL浓度为7%的NaCO3溶液和5mL的超纯水；手动充分混匀，室温下避光反应30min;用紫外可见分光光度计在765nm波长下测定没食子酸和样品反应液的吸光值(OD765);以没食子酸溶液浓度(0300mgL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线；样品的多酚含量通过没食子酸浓度吸光值的标准曲线计算得到，结果以没食子酸当量(GaniCACidEqUiVaIentS,GAE)表示。样品进行三次独立的生物学重复，数据表示为平均值±SD。4.2.5 葡萄籽超微粉类黄酮含量的测定总黄酮含量(TFC)的测定参照WangH.,(2015)中描述的方法进行，稍作修改,具体操作步骤如下：将ImL样品放于1.5mL离心管中，如果浓度过高，用超纯水进行适当稀释；将0.5mL不同浓度的芦丁或样品加入15mL的玻璃试管中；向每支试管中依次加入ImL浓度为2%的NaNO2,ImL浓度为10%的Al(NO3)3和4mL浓度为2M的NaOH,手动混匀，室温下避光反应15min;用紫外可见分光光度计在510nm波长下测定芦丁和样品反应液的吸光值(OD5o);以芦丁溶液浓度(50-1000mgL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线；样品的黄酮含量通过芦丁浓度-吸光值的标准曲线计算得到，结果以芦丁当量(rutinequivalent,RE)表示。样品进行三次独立的生物学重复，数据表示为平均值±SD.4.2.6 葡萄籽超微粉中的单体酚含量的测定称取Ig饼粕超微粉，加IOmL石油醒混匀，60%功率超声提取30min,期间每隔5min混匀一次；IOoOormin离心IOmin,去掉上清，向沉淀中加入IOmL石油酸，再重复2次；将去油后的超微粉放在通风橱中，等待石油酸完全挥发掉；将干燥后的饼粕超微粉转移到锥形瓶中，加入5mL蒸储水和45mL乙酸乙酯，摇床避光振荡30min,转移上清液于25OmL圆底烧瓶，重复4次，合并上清液，旋转蒸发仪33蒸发至干，色谱甲醇定容至3mLo样品中酚酸含量的测定参照尹承苗等(2013)描述的方法进行，具体操作步骤如下：提取获得的各种酚类样品经过0.22m过膜；色谱条件：色谱柱为Acclaim120C18(150mmx3mm,3m,Dionex,美国)，柱温保持在30,流动相A为乙月青，流动相B为ddH2(乙酸调PH至2.6),流速为0.5mLmin,进样体积为5L,进样方式为自动进样，检测波长为280nm；酚酸组分的定性和定量分析用肉桂酸，水杨酸，香豆素，苯甲酸，阿魏酸，香兰素，丁香酸，香兰素，绿原酸，对羟基苯甲酸，原儿茶酸，没食子酸等相应的外部标准品进行。4.2.7 葡萄籽超微粉抗氧化能力的测定4.2.7.1 DPPH法DPPH自由基清除活性测定参照Blois(1958)中的方法进行，稍作修改，具体操作步骤如下：将ImL样品放于1.5mL离心管中，如果浓度过高，用超纯水进行适当稀释;将20L不同浓度的TrolOX和样品与2mL浓度为6.5×IO5M的DPPH(溶解于甲醇)溶液在IOmL离心管中混合，手动充分混匀后，在室温下避光孵育30min;用紫外可见分光光度计在517nm波长下测定相应反应液的吸光值(OD517)；以Trolox浓度(100-100OgM)为横坐标，吸光值(OD517)为纵坐标绘制标准曲线；样品清除DPPH自由基的能力通过Trolox浓度-吸光值的标准曲线计算得到，结果用Trolox当量(TroIOXequivalent,TE)表示。4.2.6.2ABTS法ABTS自由基清除能力的测定使用ABTS总抗氧化能力测定试剂盒，根据试剂盒生产制造商提供的说明书进行，具体操作步骤如下：首先将ABTS溶液和氧化剂溶液(1:1,vv)配制成ABTS工作母液，配制成的ABTS工作母液需室温避光存放1216h方可使用。配制成的ABTS工作母液室温避光存放，23天内稳定。根据样品的数量(含标准曲线)配制适量的ABTS工作液，具体如表1：表1ABTS工作母液的配制待测定样品数Numberoftestedsamples约1220个约30-50个约60-100个约120-200个ABTS溶液40微升100微升200微升400微升氧化剂溶液40微升100微升200微升400微升ABTS工作母液80微升200微升4(X)微升800微升使用前，把ABTS工作母液用PBS或80%乙醉稀释成ABTS工作液，要求ABTS工作液的吸光度减去相应的PBS或80%乙醇空白对照后，A405在1.4左右。当待检测水溶性样品时，用PBS稀释，此时ABTS工作母液的稀释倍数约为30-50倍；当待检测酒样时，用80%乙醇稀释，此时ABTS工作母液的稀释倍数约为3555倍；将ImL样品放于1.5mL离心管中，如果浓度过高，用超纯水进行适当稀释；将200微升ABTS工作液加入96孔板的每个检测孔中；向96孔板的每孔中加入10L不同浓度的Trolox或样品，轻轻混匀后，室温避光孵育6min；用多功能酶标仪在405nm波长下测定反应液的吸光值(OD405);以TrOk)X浓度(100-750M)为横坐标，吸光值(OD405)为纵坐标绘制标准曲线；样品ABTS自由基清除能力通过TrOk)X浓度.吸光值的标准曲线计算得到，结果用TrOIoX当量(TrOloXequivalent,TE)表示。426.3FRAP法Fe3+还原能力(FRAP)的测定参照BenZieandStrain(1996)中的方法进行，稍作修改，具体操作步骤如下：将浓度为30mM的醋酸缓冲液(pH=3.6),20mM的氯化铁和IOmM的TPTZ(溶于40mM的HCD以10:1:1(vvv)的比例混合，在37温度下水浴加热5min,制备成FRAP工作液。将ImL样品放于1.5mL离心管中，如果浓度过高,用超纯水进行适当稀释；将10L不同浓度的TrOIoX或样品与ImL超纯水置于IOmL的离心管中，手动充分混匀；向离心管中加入1.8mLFRAP工作液，手动充分混匀，37下避光孵育10min；用紫外可见分光光度计在593nm波长下测定反应液的吸光值(OD593)；以TrOlOX浓度(100-10000M)为横坐标，吸光值(OD593)为纵坐标绘制标准曲线；样品Fe3+还原能力通过Trolox浓度-吸光值的标准曲线计算得到，结果用Trolox当量(TrOlOXequivalent,TE)表示。4.3统计分析使用SPSSI6.0对所有数据进行统计学分析，葡萄酒样品之间的显著差异通过方差分析和DUnCan检验进行，模型在P0.05水平具有统计学意义。五、结果与分析5.1 不同去油方法对葡萄籽超微粉的影响根据422中描述的方法对葡萄籽进行了去油处理，结果如表2所示。由表2可以看出，三种处理方法中冷处理获得的葡萄籽超微粉中所含的总酚和类黄酮含量最高，分别为78.32mgGAE/g和67.59mgREg,其次是热处理，有机溶剂获得的葡萄籽超微粉中的总酚和类黄酮含量最低，分别为50.14mgGAE/g和45.32mgREg°表2不同去油方法对葡萄籽超微粉的影响总酚(mgGAE/g)类黄酮(mgRE/g)有机溶剂50.1445.32冷处理78.3267.59热处理59.3453.255.2不同处理方式对葡萄籽超微粉单体酚含量的影响根据426中描述的方法对不同处理获得的葡萄籽超微粉中单体酚含量进行了测定,结果如表3所示，由表3可以看出液相色谱法测得的不同处理获得的各单体酚含量差异较大，但液相色谱法获得的单体酚总含量与色谱法获得的总酚的含量结果趋势相一致，单体酚总含量由大到小为：冷处理热处理有机溶剂处理。冷处理获得的单体分总含量为59.74mgg,有机处理获得的单体总酚含量为23.17mgg,热处理获得的单体总酚含量为32.23mgg,且热处理获得了最高含量的绿原酸(18.35mgg)。其液相色谱图分别见图1,图2,图3。表3不同处理方式对葡萄籽超微粉单体酚含量的影响热处理有机处理冷处理没食子酸0.040.972.82儿茶素0.110.056.52对羟基苯甲酸7.044.089.19绿原酸18.353.621.97香草酸1.030.231.44丁香酸4.277.3312.97香兰素0.080.590.74阿魏酸0.090.177.82苯甲酸0.291.245.98根皮背0.524.025.99香豆素0.020.081.47水杨酸0.200.732.29肉桂酸0.160.020.53根皮素0.040.040.01合计(mgg)32.2323.1759.74图1热处理去油后葡萄籽多酚液相色谱图.-,>-图2有机处理葡萄籽多酚液相色谱图IAiJ 灿 WjUwww:、IgWnIWUeIMICT IC« ui图3冷榨去油后葡萄籽多酚的液相色谱图5.3 不同处理葡萄籽超微粉对抗氧化能力的影响对不同处理方式葡萄籽超微粉抗氧化能力进行测定，结果如表4所示。抗氧化能力测定方法就包括体内和体外抗氧化能力测定方法。两种测定方法各有各的优点，平时我们最常用的是体外抗氧化测定方法，做实验时我们会选择简单方便，而且成本低的方法，体外抗氧化测定方法就是因为具有这些优点所以成为了研究时常用的方法。体外抗氧化能力的测定方法又包括很多种，但是从作用机理来看主要可以概括为两类：第一类就是如酚类物质等清除自由基的能力；第二类就是还原金属离子如铁离子的能力。较常用的方法有DPPH法、FRAP法等。目前还没有一种方法能同时准确反映所测定的物质中所有抗氧化物质的抗氧化活性。因此，我们至少需要采用两种互补的方法来评价分析物质的抗氧化能力。所以本次研究采用DPPH法、FRAP法、ABTS法三种方法分别对3个不同种植区葡萄的葡萄籽的抗氧化性能进行了评价分析。抗氧化测定结果见表3,可以发现三种处理的葡萄的葡萄籽中的酚类物质使用不同的抗氧化活性测定方法测定时表现出的抗氧化能力有明显差异，但是都表现出大致相同的趋势，其顺序为冷处理>有机处理热处理。表4不同处理葡萄籽超微粉对抗氧化能力的影响热处理有机处理冷处理DPPH(TEMg)14.929.178.4FRAP(TEMg)24.654.4147.8ABTS(TEMg)39.344.6207.0DPPH自由基并不是天然存在的，可以说它是很稳定的，它的醇溶液在517nm处具有最大的光吸收度。在含有能提供质子的抗氧化剂时，我们可以看到DPPH混合溶液的颜色变浅，而且吸光度变小了。由这种变化就可以得出自由基的清除能力来。所以使用DPPH法可以通过在发生反应时减少混合物中的存在的自由基，然后继续得出所测定出的三个产区的葡萄籽的抗氧化能力。从表3中可以看出，利用DPPH法测定酚类化合物抗氧化能力能力时，在三个产区的葡萄品种栽培条件一致的情况下，它们之间的抗氧化能力具有可比性，呈现出冷处理>有机处理>热处理。5.4 饲喂葡萄籽超微粉对小白鼠免疫影响因子的影响处理A、B、C、D和E分别为20克葡萄籽+0克超微粉，15克葡萄籽+5克超微粉,10克葡萄籽+10克超微粉，5克葡萄籽+15克超微粉及0克葡萄籽+20克超微粉等5个组合，其中超微粉均选择冷榨超微粉。由表4可知，小白鼠血清中免疫因子IgM(P<0.01)、IgG(P<0.05)和IL-l(P<0.01)的含量随饲粮中WEAe)添加量的增加呈显著的一次线性升高效应，且。克葡萄籽+20克超微粉的剂量组较为突出。小白鼠肠组织中SIgA含量未呈现出明显的变化规律。由此可见，超微粉可明显提高小白鼠的免疫因子活力。ABCDEIgM(mgL)1.091.131.261.281.47IgG(mg/L)196208207229236IL-(mg/L)4741.853.060.764.5IL-2(mg/L)13.516.315.714.114.5七.结论研究表明，低温(30-35oC)冷榨，超微粉粒径小于1025m,饲喂葡萄籽超微粉20克，可明显提高小白鼠免疫影响因子的活力。参考文献：Blois,M.S.Antioxidantdeterminationsbytheuseofastablefreeradical.Nature,1958,181:1199-1200.Singleton,V.L.,Orthofer,R.,andRosaMLamuela-Raventos.Analysisoftotalphenolsandotheroxidationsubstratesandantioxidantsbymeansoffblin-ciocalteureagent.Methodsinenzymology,1999,299C(1):152-178.Wang,X.Q.,Li,C.,Liang,D.,Zou,Y.,Li,B,andMa,EPhenoliccompoundsandantioxidantactivityinred-fleshedapples.JournalofFunctionalFoods,2015,18:1086-1094.Benzie,I.EE,andStrain,J.J.Ferricreducingabilityofplasma(FRAP)asameasureofantioxidantpower:TheFRAPassay.AnalyticalBiochemistry,1996,239:70-76.隋银强.2014.酿酒葡萄皮渣的干燥工艺研窕硕士学位论文.杨陵:西北农林科技大学李华，袁春龙，沈洁.2007.超微粉碎技术在葡萄籽加工中的应用.华南理工大学学报:自然科学版,35(4):123126.