莱菔素抗食管鳞癌活性评价及机制研究.docx

莱第素抗食管鳞癌活性评价及机制研究摘要食管癌是全球范围内患病率第八，死亡率第六的癌症，包括中国在内的多个亚洲地区是其高发区域。食管癌包含食管鳞癌和食管腺癌两种亚型，其中食管鳞癌的占比超过70%o罹患食管鳞癌的患者最典型的症状就是胸骨后或肩胛间区域疼痛，吞咽困难及由此引发的体重下降、营养不良现象。由于这些症状通常在肿瘤发展到中晚期时才会慢慢显现，很多患者确诊时已经错过了最佳治疗阶段，导致食管鳞癌的预后较差，五年生存率仅10%-15%o因此进一步研究食管鳞癌发生发展相关机制并确认新的治疗策略与作用靶点对降低患者死亡率、提升总体生存时间至关重要。多项研究证实十字花科植物具有很好的抗癌防癌效果，其中起关键作用的是异硫氟酸酯类物质，可以抑制多种肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡。莱版素作为异硫氟酸酯家族成员之一，近几年受到了越来越多研究人员的关注。它可以阻碍多条经典信号通路发挥促癌效果，并能激活在癌细胞中失活的明星抗癌因子，促进细胞周期阻滞与细胞凋亡，从而达到调控肿瘤增殖与侵袭转移能力的效果。本篇研究主要围绕着莱酸素抗食管鳞癌发生发展的活性大小与相关作用机制展开。我们首先进行了移植瘤实验，发现莱腋素处理的裸鼠与对照组裸鼠相比，体内肿瘤的大小与重量显著减小，而体重则没有太大差别，这说明莱版素在不影响裸鼠正常生活的前提下，可以有效延缓体内食管鳞癌肿块的增殖速率。之后在两种食管鳞癌细胞中进行的细胞活性测定与克隆形成实验说明莱版素对细胞生长的抑制效果具有时间依赖性与剂量依赖性，而流式细胞仪检测及相关蛋白免疫印迹实验结果表明莱施素对食管鳞癌增殖的抑制作用癌增殖的抑制作用是通过引发G2/M期细胞周期阻滞与细胞凋亡来实现的。随后我们通过划痕愈合实验与Transwell实验证明莱版素还可以显著抑制癌细胞的侵袭转移能力。鉴于莱藤素表现出了较强的抗食管鳞癌活性，我们接下来通过基因芯片对莱版素处理前后细胞中基因的表达量进行检测，以此寻找将莱薇素与食管鳞癌细胞表型变化连接起来的靶基因与靶信号通路。芯片结果与后续验证实验表明SCD和CDH3以及p53通路是药物处理细胞后表达量变化最显著的基因与信号通路，最有可能参与莱藤素抑制食管鳞癌发生发展的过程。我们通过挽救实验确认莱藤素确实是通过调控SCD和CDH3表达来下调食管鳞癌侵袭转移速度，并且数据库预测与随后的蛋白免疫印迹实验均表明Wnt通路位于这两个基因下游，莱瓶素抑制基因表达后，Wnt通路随之失活。我们发现SCD和CDH3对细胞生长没有明显作用,这意味着还有其他莱版素的靶基因参与调控细胞的增殖过程。莱腋素对p53的转录后调控作用使我们想到了p38通路这一常见的p53激活子,而调节p38活性的上游基因GADD45B和MAP2K3在莱敢素作用下表达量明显提高，并且降低它们的表达会显著影响莱施素对食管鳞癌细胞生长的抑制作用。CO-IP实验表明GADD45B可以激活MAP2K3并发挥p38活化因子的作用，再加上GADD45B已被证实是p53靶基因之一，因此我们确定莱版素激活细胞内正反馈调节环GADD45B-MAP2K3-p38-p53来降低食管鳞癌生长速率。过表达SCD,CDH3或降低GADD45B,MAP2K3表达量均会影响莱版素对食管鳞癌发生发展的调控作用，但没有完全抵消这种抑制效果，说明还存在其他关键效应因子。我们利用GSEA富集方法重新分析基因芯片结果，发现NFKB通路与莱版素发挥作用密切相关，并通过与GEo数据库下载的数据集进行对比,确认了CXCLlO,INHBA,TNFAIP3和PLAU是莱酸素靶基因中推动食管鳞癌发展的重要因子。数据库预测NFkB通路位于这4个基因上游，通过结合到基因启动子或增强子上发挥转录激活作用。我们挑选莱第素处理后表达量变化最明显的TNFAIP3和PLAU进行验证，确认莱腋素通过抑制NFkB作为转录因子与基因直接结合来调控基因表达，最终达到抑制食管鳞癌细胞增殖与转移的效果。实验结果表明莱服素具有很强的抗食管鳞癌效果，本篇研究比较详细地分析了其体内体外抑制食管鳞癌发生发展地作用机制，为将来应用这一潜力巨大的抗癌药物治疗食管鳞癌打下了坚实基础。关键词：食管鳞癌，莱服素，SCD,CDH3,GADD45B-MAP2K3-p38-p53,NFkB通路IVSTUDYONTHEACTIVITYANDMOLECULARMECHANISMOFSULFORAPHENEONESOPHAGEALSQUAMOUSCELLCARCINOMAABSTRACTEsophagealcanceristheeighthprevalenceandsixthmortalitycancerworldwide,andmanyAsianregions,includingChina,areareaswithahighincidenceofit.Esophagealcancerisprincipallycomprisedoftwopathologicallydistinctdiseases,esophagealsquamouscellcancer(ESCC)andadenocarcinoma(EAC),andESCCaccountsfor70%ofesophagealcancercasesworldwide.ThemosttypicalsymptomsofESCCarepainbehindthebreastboneorbetweentheshoulderblades,dysphagia,andtheresultingweightlossandmalnutrition.Assymptomsmaybenoticeableonlywhenthetumorhasreachedarelativelyadvancedstage,thegeneralprognosisispoor,andthe5-yearsurvivalrateisonly10%-15%.Therefore,understandingoftheepidemiology,pathology,andmolecularmechanismsofESCC,andproposalsofnoveltherapeuticstrategiesandmoretreatmentoptionsforpatientsareurgentlyneeded.Anumberofstudieshaveconfirmedthatcruciferousplantshavesatisfiedanti-cancereffects,andthebiggestcontributorisisothiocyanates,whichcaninhibitthegrowthofvarioustumorcellsandinducecellapoptosis.Asamemberoftheisothiocyanates,Sulforahene(SFE)hasreceivedmoreandmoreattentioninrecentyears.Itcanhindermultiplesignalingpathwaysfromexertingtheircancer-promotingeffects,andactivatekeyantitumorfactorsthatareinactivatedincancercellstopromotecellcyclearrestandapoptosis,achievingtheeffectsofregulatingtumorproliferationandmetastasis.ThisresearchmainlyfocusontheactivityandrelatedmechanismofSFEagainsttheoccurrenceanddevelopmentofESCC.Wefirstperformedthexenografttumorassay,andfoundthattherewasnosignificantdifferenceinmicebodyweight,whilethetumorvolumeandlumpsweightinmicetreatedwithSFEwereobviouslysmallerthanthatofthecontrolgroup,indicatingthatSFEcouldeffectivelydelaytheproliferationofESCCinvivowithoutaffectingthehealthyofnudemice.WethenexaminedtheroleofSFEintwoESCCcelllinesbycellviabilityandcolonyformationassays,findingatime-dependentanddose-dependentinhibitionofSFEoncellproliferation.FACSanalysesandwesternblottingresultsindicatedtheinhibitoryeffectofSFEontheproliferationofESCCwasachievedbyinducingG2Mcellcyclearrestandapoptosis.Subsequently,weprovedSFEcouldalsosignificantlyinhibitcellinvasionandmigrationbyscratchhealingandTranswellassays.InviewofthestronganticanceractivityofSFE,wethenlookedfortargetgenesandsignalingpathwaysthatconnectSFEandphenotypicchangesinESCCthroughmicroarraystodetectchangesingeneexpressionbeforeandafterSFEtreatmentofESCCcells.ThemicroarraysdataandsubsequentverificationexperimentsshowedthatSCD,CDH3andp53pathwayswerethegenesandpathwaywiththemostsignificantchangesinexpressionafterSFEtreatment,whichweremostlikelytobeinvolvedinSFEinhibitingESCCprogression.WeconfirmedthroughrescueexperimentsthatSFEactuallysuppressedESCCmetastasisbyregulatingtheexpressionofSCDandCDH3.DatabasespredictedandsubsequentwesternblottingshowedthattheWntpathwayislocateddownstreamofthetwogenes,andonceSFEinhibitsgeneexpression,theWntpathwayisinactivated.WefoundthatSCDandCDH3hadnoobviouseffectsoncellprliferation,whichmeantthattherewereothertargetgenesofSFErelatedtothisregulationprocess.Thepost-transcriptionalregulationofp53bySFEremindedusofacommonp53regulator,thep38pathway,theactivatorsofwhich,MAP2K3andGADD45BweresignificantlyincreasedbySFEtreatment.TheexpressionofMAP2K3andGADD45BdecreasedreversedtheinhibitoryeffectofSFEonESCCcellproliferation,andco-IPresultsindicatedthatGADD45B,aknowntargetofp53,couldpromotethephosphorylationlevelofMAP2K3.Thus,wecoulddrewaconclusionthatSFEactivatedthepositivefeedbackloopGADD45B-MAP2K3-p38-p53toinhibitESCCproliferation.OverexpressionofSCDandCDH3orreductionofGADD45BandMAP2K3expressioncouldaffecttheregulationeffectsofSFEonESCCprogression,yetnotcompletelyoffset.Wethoughtthattherewereothervitaleffectors,andreprocessedthemicroarraysdatabyGSEA,findingthattheNFkBpathwaywasassociatedwithSFEinhibitionofESCCproliferationandmetastasis.WedownloadedandprocessedtwodatasetsfromtheGEOdatabase,andidentifiedCXCLlO,INHBA,TNFAIP3andPLAUwerethetargetgeneofSFEinESCC.TheCistromedatabasepredictedthattheNFkBpathwayactsasatranscriptionfactortoregulationgeneexpressionbybindingtothepromoterorenhancerregionofCXCLlO,INHBA,TNFAIP3andPLAU.WeselectedTNFAIP3andPLAUwiththemostobviouschangesinexpressionafterSFEtreatmentforverification,confirmingthatSFEregulatedgeneexpressionbyinhibitingNFkBtodirectlybindtogenesandeventuallyinhibitedESCCprogression.AlltheresultssuggestthatSFEhasastronginhibitoryeffectonESCCdevelopment,andthisstudyanalyzethespecificmechanismofSFEinhibitingESCCprogression,provingthatSFEisapromisingchemotherapeuticagentthatmaybeusedtotreatESCCinthefuture.KEYWORDS：esophagealsquamouscellcancer,Sulforaphene,SCD,CDH3GADD45B-MAP2K3-p38-p53,theNFkBpathway目录第一章绪论11.1 食管鳞癌概述11.1.1 风险因素11.1.2 分子特征11.1.3 治疗手段21.2 异硫氤酸酯抗癌活性研究31.2.1 芥酸41.2.2 引咪-3-甲醇51.2.3 莱版硫烷61.2.4 莱薇素71.3 立项背景与研究意义8第二章莱瓶素抑制食管鳞癌活性评价92.1 实验材料92.1.1 莱萌素92.1.2 实验细胞株92.1.3 实验试剂92.1.4 实验设备102.2 实验方法112.2.1 体内移植瘤实验112.2.2 细胞培养122.2.3 细胞生长检测122.2.4 克隆形成实验132.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期132.2.6 caspase蛋白活性检测142.2.7 westernblotting检测蛋白表达水平152.2.8 划痕实验182.2.9 Transwell实验182.3 结果与讨论192.3.1 莱第素抑制体内食管鳞癌生长192.3.2 莱瓶素抑制食管鳞癌细胞增殖202.3.3 莱薇素抑制食管鳞癌细胞侵袭转移232.4 本章小结25第三章莱版素抑制食管鳞癌机制研究273.1 实验材料273.1.1 实验试剂273.1.2 实验设备303.2 实验方法313.2.1 基因芯片分析313.2.2 实时荧光定量PCRCqRT-PCR)检测323.2.3 构建质粒和siRNAs343.2.4 细胞计数353.2.5 提取细胞核蛋白353.2.6 免疫共沉淀(Co-IP)实验363.3 结果与讨论363.3.1 确认莱版素靶基因363.3.2 SCD和CDH3对莱版素抑制食管鳞癌进程的影响383.3.3 莱髓素抑制食管鳞癌细胞转移相关信号通路423.3.4 莱瓶素抑制细胞增殖靶信号通路463.4 本章小结54第四章莱版素阻断NFkB通路来抑制食管鳞癌进程574.1 前言574.2 实验材料574.2.1 实验试剂574.2.2 实验设备594.3 实验方法614.4 .3构建质粒和siRNAs614.5 .4染色质免疫沉淀-PCR(ChIP-PCR)实验614.6 .5报告基因实验624.7 结果与讨论624.4.1 确认莱瓶素的关键靶标624.4.2 分析CXCLlO、TNFAIP3、INHBA和PLAU的表达特征654.4.3 莱瓶素抑制NFKB通路的转录激活作用674.4.4 莱瓶素抑癌作用与调控NFkB通路活性有关714.5本章小结73第五章结论、创新点与展望755.1 结论755.2 创新点765.3 展望76参考文献79Contents1 Introduction11.1 Overviewofesophagealsquamouscellcarcinoma11.1.1 Riskfactors11.1.2 Molecularcharacteristics11.1.3 Treatment21.2 Anticanceractivityofisothiocyanate31.2.1 Erucicacid41.2.2 Indole-3-carbinol51.2.3 Sulforaphane61.2.4 Sulforaphene71.3 Backgroundandsignificance82 EvaluationoftheinhibitoryactivityofSFEonESCC92.1 Materials92.1.1 Sulforaphene92.1.2 Celllines92.1.3 Reagents92.1.4 Equipment102.2 Method112.2.1 Xenografttumorassay112.2.2 Cellculture122.2.3 Cellviabilityassay122.2.4 Colonyformationassay132.2.5 Cellapoptosisandcellcycleanalysis132.2.6 caspaseactivityassay142.2.7 westernblottingassay152.2.8 Woundhealingassay182.2.9 Transwellassay182.3 Resultsanddiscussion192.3.1 SFEinhibitsthegrowthofESCCinvivo192.3.2 SFEinhibitstheproliferationofESCCcells202.3.3 SFEinhibitsthemetastasisofESCCcells232.4 Chaptersummary25第三章StudyonthemechanismofSFEininhibitingESCC273.1 Materials273.1.1 Reagents273.1.2 Equipment303.2 Method313.2.1 Microarraydetection313.2.2 qRT-PCR323.2.3 ConstructplasmidandsiRNAs343.2.4 Cellcounting353.2.5 Extractnuclearprotein353.2.6 Co-immunoprecipitationassay363.3 Resultsanddiscussion363.3.1 ConfirmthetargetgenesofSFE363.3.2 EffectsofSCDandCDH3ontheinhibitionofSFEonESCC383.3.3 SFEinhibitsESCCmetastasis-relatedpathways423.3.4 SFEinhibitsESCCproliferation-relatedpathways463.4 Chaptersummary543.5 SFEblockstheNFkBpathwaytoinhibittheprogressionofESCC574.1 Preface574.2 Materials574.2.1 Reagents574.2.2 Equipment594.3 Method614.4 .3ConstructplasmidandsiRNAs614.5 .4Chromatinimmunoprecipitation-PCRassay614.6 .5Luciferasereporterassay624.7 Resultsanddiscussion624.4.1 IdentifythekeytargetsofSFE624.4.2 Analyzegeneexpressioncharacteristics654.4.3 SFEinhibitstranscriptionalactivationofNFkBpathway674.4.4 ThetumorsuppressoreffectofSFEisrelatedtotheregulationofNFkBpathwayactivity714.5Chaptersummary735Conclusioninnovationandoutlook755.1 Conclusion755.2 innovation765.3 outlook76References79XV符号和缩写词说明缩略语英文全称中文全称ESCCEsophageaIsquamouscellcancer食道鳞状细胞癌EACEsophagealadenocarcinoma食管腺癌SFESulfbraphene莱戚素FBSFetalbovineserum胎牛血清DMSODimethylsulfoxide二甲基亚飒IC50Halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance半数抑制浓度qRT-PCRQuantitativerealtimePCR实时荧光定量PCRDEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯PMSFPhenyImethanesulfbnyl11uoride苯甲基磺酰氟TBSTTrisBufferedsalineTweenTris-HCl缓冲盐溶液+TweenEDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液TEMEDN,N,N',N1-TetramethylethyIenediamineN,N,NN;四甲基二乙胺PIPropidiumIodide碘化丙喔SDSSodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠APSAmmoniumpersulphate过硫酸筱EMTEpithelial-mesenchymaltransition上皮细胞间质转化NCNegativecontrol阴性对照co-IPCo-Immunoprecipitation免疫共沉淀KEGGKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes京都基因与基因组百科全书GSEAGeneSetEnrichmentAnalysis基因富集分析ChIPChromatinImmunoprecipitation染色质免疫沉淀TCGATheCancerGenomeAtlas癌症基因组图谱数据库GTExGenotype-TissueExpression基因型组织表达数据库RNA-seqRNASequencing转录组测序GOGeneOntology基因本体论XVIII第一章绪论1.1 食管鳞癌概述食管癌是全球确诊率第八高的癌症，2013年新增约442000名确诊患者，同时有440000人死于食管癌。其高发区域从中国北部（年发病率约为1/1000）开始延伸至东亚地区直至伊朗北部山。食道鳞状细胞癌和腺癌是食道癌的两个主要亚型，其中鳞癌占全球食管癌总病例数的70%。早期食管鳞癌的临床表现不明显，很容易被患者忽略,这也导致出现确诊时癌症已经进展到中晚期的情况。中晚期患者经常出现进行性吞咽困难、身体消瘦、黏液样呕吐物（唾液与食管分泌物质的混合物）、胸骨疼痛或涨闷不适等症状。这些典型症状的出现通常意味着患者已经错过了最佳治疗时机，因此食管癌的预后较差，5年生存几率仅为10%-15%°1.1.1 风险因素过量饮酒以及长期吸烟都会增加食管鳞癌患病几率。烟草中含有多环燃、亚硝胺和乙醛等有害物质，长期大量吸烟会导致食管鳞癌患病风险增加5-9倍2,饮酒对食管粘膜的危害主要由酒精的代谢产物乙醛引发，而亚洲人群酒精代谢的遗传性特征加剧了这一群体乙醛暴露的程度4习。同时酒精和烟草还对食管鳞癌发生这一事件具有协同作用，二者同时存在会将癌症发生几率再提升3倍网。水果蔬菜摄入量过低、进食过热食物导致粘膜反复热损伤以及某些特定地区存在的微量元素缺乏症同样会诱发食管鳞癌亿8,9。除了这些后天形成的生活习惯外，一些家族遗传性疾病也会促进食管鳞癌产生。食管就眼症是RHBDF2基因生殖突变导致的常染色体显性遗传疾病，患者70岁时摧患食管鳞癌的风险会累积到90%"。L中国就食管鳞癌患病风险开展的全基因组关联性研究揭示了其易感位点：10q23（编码PLCEl基因）,5q31.2（编码TMEMI73基因），17pl3.1（编码ATP1B2基因）伍。体内代谢过程关键基因的遗传变异还会影响环境因素与食管鳞癌发生几率的相关性，例如不改变生活方式的前提下，乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶编码基因发生突变，人群患食管鳞癌几率明显上升“41。1.1.2 分子特征食管鳞癌来源于食道粘膜被烟草、过热食物、胃酸或胆汁回流等反复刺激后，基底细胞出现典型和高阶非典型异常增生，并累积形成原位癌。这个过程中P53和细胞周期相关蛋白的失调是食管发生癌变的关键分子特征。研究人员已经证实在发生非典型增生和出现癌细胞的食道内，p53蛋白异常表达并大量积累，而CDKN2A/RB1的过表达与病变部位从炎症发展为癌症的过程正相关【。正确识别出现增生的异常组织对于防止食管进一步癌变，保障患者身体健康十分关键。对正常组织和增生组织进行基因表达差异性分析，识别出了TNFAlP3和CHN这两个关键标志物，它们的表达水平会按照正常组织增生组织癌变组织的顺序依次递增，因此可以通过对比基因表达情况来诊断食管组织病变情况网。近几年开展的大规模测序与多平台多组学关联研究对食管鳞癌进行了包括突变情况、转录组差异、表观遗传学在内的全面分析，发现与正常组织相比，食管癌样本中p53基因（91%）,MLL2基因（17%）和NFE2L2基因（14%）最常出现点突变或插入缺失突变，而SOX2/TP63基因（48%）和FGFRl基因（12%）经常发生异常扩增“mo）。同时确认了可作为食管癌诊断或治疗靶点的信号通路，涉及细胞周期调控、酪氨酸激酶受体、染色质重组等多个方面，比如EGFR和PIK3CA通路分别在19%和24%的肿瘤样本中异常激活。1.1.3 治疗手段治疗措施的选择取决于患者特征与自身适应性以及肿瘤的TNM分期情况：早期肿瘤可以采取内镜切除的手段，而中晚期癌症更适合通过放疗、化学疗法、手术切除或是几种方法组合在一起进行治疗；对于不适合进行手术的患者进行全身化疗。1.1.3.1 内镜治疗内镜治疗包括内镜粘膜切除、内镜粘膜剥离以及激光疗法、射频治疗、光动力疗法等非切除治疗。当食管癌局限于粘膜部位且无任何转移时，内镜治疗是最佳的治疗手段，因为它创伤小、恢复快、对患者的生活质量影响更小L另外，对于处于Tl期同时因为高龄或有严重并发症而无法进行手术或放化疗的患者来说，如果无淋巴管浸润、分化良好并且粘膜下浸润处于1级，也可以尝试进行内镜治疗2、虽然食管鳞癌处于早期的患者占比较小，更多的患者用内镜治疗只能起到暂时缓解的作用，不过将其作为筛查与辅助治疗手段对于监测癌变进程并及时进行干预治疗、改善患者身体状态仍然有很大帮助。1.1.3.2 手术切除对于处于胃食管连接处或附近的肿瘤，可采用食管切除术与胃近端切除术结合或全胃切除术与远端食管切除术结合的方式进行切除，研究人员对3356名患者进行回访确认这些方式的选择对患者的5年生存期和癌症复发率无明显影响12,而手术中淋巴结清除治疗的最优范围现在仍有争议，有些研究显示较为广泛的清除淋巴可以得到更好的预后效果侬】，有些研究则表明切除更多淋巴对提高患者生存期毫无帮助251,这意味着效果很可能是因人而异的，需要对肿瘤起始部位与特征、患者正在接受的辅助治疗手段进行全面分析后再作决定。患者自身特点对术后效果有较大影响：具有一些合并症和心脏健康程度低的患者手术预后较差BMI指数较大的患者术后容易产生更多的并发症，不过总体生存率更高282叫吸烟和大量饮酒对患者生存期具有不利影响13。，31另外受教育时间较长的人群具有更好的术后生存效果并且这一点独立于其他所有预后因素P'1.1.3.3 化疗和放疗对于TNM分期大于等于T2期的患者来说，仅进行手术切除治疗效果不佳，通常会采用放化疗的方法来减少原发肿瘤体积、增加根治性手术切除的可能性并降低将来癌症复发的风险，还可以改善吞咽困难的症状，有效提升患者的营养状况31。食管鳞癌对放化疗高度敏感，很多患者在治疗后出现了持久的完全病理反应，甚至有部分患者无需再进行手术切除治疗也可以达到等同的生存时间，这一点也引起了很多临床医生与科研工作者的高度关注四，3式研究发现在手术治疗前进行1或2个周期的氟尿喀咤治疗，患者的6年生存期可以提升8%P%与只进行手术治疗相比，同时接受顺钳或紫杉醇化疗的患者总体生存期也明显增加PL另外接受放化疗作为辅助治疗的患者术后发生局部或全身系统性复发的风险也有所降低阴】。虽然目前食管鳞癌的治疗手段多样，但仍然存在很大的局限性：内镜治疗只适用于癌症处于较早时期的患者；年龄偏大、身体素质较差或具有其他并发症的患者无法进行手术治疗；约有2/3患者接受放化疗后，病理反应不乐观，同时随着治疗时间的增加，部分患者开始产生耐药性。因此更为深入地了解食管鳞癌发生发展的分子机制与病理特征、寻找更为高效且具有普适性的治疗策略、确认更有针对性的治疗靶点对降低癌症死亡率与复发风险同时提升患者的生活质量十分重要。1.2 异硫氨酸酯抗癌活性研究很多植物的次生代谢产物具有抗癌活性，例如喜树碱、鸦胆子苦醇、冬凌草甲素、秋水仙碱、紫杉醇、鬼臼毒素等，但在实际临床应用中人们发现这些物质具有较强的生物毒性，在杀伤癌细胞的同时对正常细胞也会造成极大损害。因此研究人员逐渐将注意力放在了同样具有抗癌效果但毒副作用较小的天然代谢产物上。包括西兰花，白菜，圆白菜，紫甘蓝，菜花，大头菜，芥末，萝卜在内的十字花科植物含有叶酸、纤维素、类胡萝卜素、叶绿素等许多对人体有益的营养物质，硫代葡萄糖甘也是其中之一。人们食用十字花科蔬菜后，其中富含的硫代葡萄糖甘被肠道中的黑芥子酶水解后生成具有生物活性的化合物，例如叫蛛和异硫氟酸酯（图11）1391O异硫鼠酸酯有很强的抗癌活性，可以通过抑制参与调控癌症起始和增殖途径的蛋白质来有效抑制细胞增殖|4叫还会刺激细胞内活性氧积累并诱发细胞凋亡、自噬和周期阻滞L除了对癌细胞造成损伤外，异硫氨酸酯同样可以阻断正常细胞的癌变过程。它能够激活解毒酶和抗氧化酶并减少细胞DNA损伤的发生几率，促进胞内关键基因正常表达ML介酸、口引噪3甲醇和莱服硫烷是异硫氟酸酯中比较知名的3种化合物，大量研究成果证明它们可以抑制癌症发生发展并且具有良好的生物利用度，因此有望成为临床癌症治疗的备选药物。RGlUCoSe H2OIlNOSO3'Myrosinase+ GlucoseGlucosinolateNOSO3-Thiobydroxamate-O-Sutfonate-HSO4-neutral pH图1-1黑芥子醐水解硫代葡萄糖件反应Figure 1-1 Myrosinase hydrolysis of glucosinolates1.2.1 芥酸图1-2芥酸的分子结构Figure1-2Themolecularstructureoferucicacid人体通过包括抑制I相活化酶（细胞色素b5还原酶，细胞色素p450还原酶，细胞色素b5,细胞色素p450,细胞色素p420）和刺激11相解毒酶（谷胱甘肽S-转移酶,DT-黄递酶，Y-谷氨酰三肽酶）在内的一系列反应代谢致癌物，而芥酸通过降低I相酶活性并活化II相酶来促进体内化学致癌物的代谢M3】。它与Keapl蛋白结合从而保护Nrf2蛋白不受Keapl抑制作用的影响并易位至细胞核中行使转录因子功能阳。Nrf2下游靶基因编码多种具有细胞保护活性的蛋白，功能涉及抑制炎症反应、促进NADPH生成、平衡细胞内铁离子含量、物质运输等Ml,11相解毒酶也是其中之一，Nrf2结合到这些基因的启动子区并促进基因表达，最终实现抑制癌症发生的作用。研究表明，芥酸还可以促进细胞周期阻滞以及诱导细胞凋亡来发挥抗癌作用：结肠癌细胞在芥酸处理后产生G2/M周期阻滞、线粒体膜电位下降、细胞凋亡等变化H61；芥酸通过抑制CDC25A和CDC25C这两个细胞周期蛋